亚氨基二乙酸和汽巴蓝染料的 浓度为〇? 1-lmol/L;或者,碳酸钠的浓度为l-3mol/L,三羟甲基乙二胺的含量为5%-10%〇
[0023] 大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜连接亚氨基二乙酸,螯合铜离子,纯化组氨酸 标记的蛋白质的示意结构如下:
[0024]
[0025] 本发明的具体的实验组如下:
[0026]
[0027]
[0028] 本发明还提供一种的螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜的应用, 本发明的制备方法制备的螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜可用于分离 和纯化富含组氨酸的蛋白质或酶,其主要过程为:
[0029] (1)蛋白溶液或粗酶液的制备
[0030] 取浓度为0.2-lmg/ml的富含组氨酸蛋白质的粗蛋白混合液或粗酶液(如浓度 0. 2-lmg/ml的牛血清白蛋白(BSA)或浓度为0. 5-1. 3mg/ml的重组丝氨酸羟甲基转移 酶(SHMT)粗酶液或浓度为0. 4-0. 8mg/ml的重组pfu粗酶液或0. 2-1. 5mol/L海因酶或 0. 2-lmol/L免疫球蛋白或0. 2-lmol/L重组青霉素酰化酶,不限于所列粗酶液)。
[0031]BSA表面含有17个组氨酸残基,铜离子可以与暴露在BSA表面的组氨酸残基相 互作用,铜离子有6个配位点,其中3个点与IDA结合,另外3个点可以与BSA结合。重组 SHMT、重组pfu粗酶、重组青霉素酰化酶均含有组氨酸标记。溶菌酶是由18种129个氨基酸 残基构成的单一肽链。它富含碱性氨基酸,有4对二硫键维持酶构型,是一种碱性蛋白质, 其N端为赖氨酸,C端为亮氨酸。海因酶是一类金属依赖性酶,活性中心主要结合二价阳离 子离子,为活性所必须;免疫球蛋白即免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白 M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白E(IgE)。
[0032] (2)蛋白吸附
[0033] 取(1)中的混合酶液各5ml,分别加入螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联 亲和膜0.1-lg,调节pH=4-8,温度为4-25°C,离子浓度为0. 1-0.5mol/L,吸附1-5小时。
[0034] (3)蛋白洗脱
[0035] 取⑵中吸附目标蛋白的亲和膜,利用体积为2-10ml,浓度为0. 05-0.lmol/L咪唑 洗脱亲和膜,利用透析方法将蛋白质大分子与咪唑小分子物质分离,得到富含组氨酸的目 标蛋白或酶;
[0036] (4)膜的复性
[0037] 将(3)中的亲和膜在5ml浓度为0?1-0. 2mol/L的EDTA溶液,温度为25-30°C,浸 泡2-3h。用去离子水冲洗2-10次,室温干燥,重新螯合金属离子,吸附目标蛋白,反复进行 多次操作,实现膜的循环利用。
[0038] 具体实施例如下:
[0039]
[0040]
[0041] 上述实验的结果表明,制备的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜连接亚氨基二乙 酸(IDA)、汽巴蓝染料(Cibacronblue3GA)、三羟甲基乙二胺(TED)能够有效地螯合金属 离子,避免了金属离子的流失。对组氨酸标记的蛋白有较大的吸附量,在蛋白质的分离中具 有较大的应用前景。
[0042] 综上所述,本发明提供的螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜的制 备方法,通过上述步骤制备出来的亲和膜具有较强的机械强度,并且与现有制备的膜对组 氨酸标记的蛋白吸附能力相比,其优点在于它能避免金属离子的流失,减小了金属离子与 目标蛋白之间的空间位阻,增大了其对目标蛋白的吸附量并能有效的把目标蛋白从膜上洗 脱下来,同时发挥了亲和膜对蛋白的吸附能力与膜本身的截留效果的协同作用。本发明方 法具有一步高效吸附蛋白,操作简便,可重复利用,能耗低,有潜在的工业化应用价值等优 点。
[0043] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精 神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜的制备方法,其特征在于, 包括以下步骤: 步骤一:浓度为1% -3%的壳聚糖与浓度为3% -9%的聚乙烯醇按体积比I :(2-3)进 行混合,并加入硅胶,在50-60°C水浴中反应24-30小时,反应混合溶液倒入制膜模板,得壳 聚糖-聚乙烯醇膜; 步骤二:利用氢氧化钠溶液对壳聚糖-聚乙烯醇膜浸泡,得到孔径为5-50nm的大孔壳 聚糖-聚乙烯醇膜; 步骤三:将大孔壳聚糖-聚乙烯醇膜加入至环氧氯丙烷与氢氧化钠的混合溶液中,于 50-60°C温度下,进行交联反应,得到网状结构的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联膜; 步骤四:将网状结构的大孔壳聚糖-聚乙烯醇膜浸入至含有亚氨基二乙酸、汽巴蓝染 料或三羟甲基乙二胺的碳酸钠溶液中,在50-60°C水浴中反应8-12小时后,用水冲洗,并在 室温下晾干;再将晾干后的膜浸入至含有二价金属离子的溶液中,进行螯合金属离子,即可 得到螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜。2. 如权利要求1所述的螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜的制备方 法,其特征在于:所述壳聚糖溶于乙酸水溶液中,所述聚乙烯醇溶于水中。3. 如权利要求1所述的螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜的制备方 法,其特征在于:所述二价金属离子为铜离子、镍离子或钴离子。4. 如权利要求1或3所述的螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜的制备 方法,其特征在于:所述二价金属离子的浓度为0. 05-0. lmol/L。5. 如权利要求1或3所述的螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜的制备 方法,其特征在于:所述含有二价金属离子的溶液为CuCl 2溶液或NiCl 2溶液或CoCl 2溶液。6. -种如权利要求1所述的螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜的应 用,其特征在于:所述螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜用于富含组氨酸 的蛋白或酶的分离和纯化。7. 如权利要求6所述的螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜的应用,其 特征在于:所述螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜对富含组氨酸的蛋白或 酶进行分离和纯化的步骤如下: 步骤一:混合酶液的制备,取浓度为0.2-lmg/ml的富含组氨酸蛋白质的粗蛋白混合液 或粗酶液; 步骤二:蛋白吸附,取上述混合酶液5mL,分别加入螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙 烯醇交联亲和膜〇. lg,调节pH 4-8和离子浓度0. 1-0. 5mol/L,在温度4-25°C对富含组氨酸 蛋白或酶特异性吸附1-5小时; 步骤三:目标蛋白或酶洗脱,取步骤二中吸附目标蛋白的亲和膜,利用体积为2-10ml 浓度为〇. 05-0. lmol/L咪唑洗脱亲和膜,利用透析方法将蛋白质大分子与咪唑小分子物质 分离,得到富含组氨酸的目标蛋白或酶; 步骤书四:膜的复性,将步骤三中的亲和膜在5ml浓度为0. 1-0. 2mol/L的EDTA溶液, 温度为25-30°C,浸泡2-3h,用去离子水冲洗2-10次,室温干燥,重新螯合金属离子,吸附目 标蛋白,反复进行多次操作,实现膜的循环利用。
【专利摘要】本发明涉及一种螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜的制备方法及其应用。膜的制备包括:壳聚糖、聚乙烯醇、硅胶进行混合制得壳聚糖-聚乙烯醇膜;利用氢氧化钠溶液处理制孔;将其加入至环氧氯丙烷与氢氧化钠中,得到网状结构的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联膜;将其浸入至含有亚氨基二乙酸的碳酸钠溶液中;再将晾干后的膜浸入至含有二价金属离子的溶液中,即可得到螯合金属离子的大孔壳聚糖-聚乙烯醇交联亲和膜,其具有较强的机械强度,并对含组氨酸的蛋白质具有高效的亲和吸附能力。其应用于富含组氨酸蛋白质或酶的分离,主要包括粗酶液制备、膜对富含组氨酸蛋白质或酶的特异性亲和吸附、吸附蛋白的洗脱、膜的再生四个过程。
【IPC分类】C08L29/04, C08L5/08, C07K1/22, C08J3/24, C08J9/26, C12N9/00, C08K5/1515, C08J9/40, C08J5/18
【公开号】CN105131329
【申请号】CN201510671237
【发明人】曾嵘, 靳步昆, 杨忠华, 阮涛, 侯亚利, 龚志伟
【申请人】武汉科技大学, 湖北大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年10月16日