用于选择性转染细胞的光热衬底的制作方法
【专利说明】用于选择性转染细胞的光热衬底
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2011年5月13日提交的USSN61/486, 114的权益和优先权，其通过 引用整体并入本文用于所有目的。
[0003] 发明背景
[0004] 在生物学的许多领域中，将宽范围的1种尺寸的待运物（包括蛋白、DNA、RNA、染 色体、细胞核和无生命的颗粒，诸如量子点、表面增强的拉曼散射（SERS)颗粒和微珠）转 移进哺乳动物细胞中是非常合乎需要的。诸如胞吞等递送方法可以将待运物捕捉进核内 体中，在此处的低pH微环境和裂解酶经常导致待运物降解（LuoandSaltzman(2000)Nat. Biotechnol. 18:33-37)。病毒和化学递送方法会将待运物包装在病毒内或形成增强摄取 的化学复合物（恥1虹1^6七31(1996)5(^61?^，272:263-267 丨6181^^6七31(1987)?『〇。. Natl.Acad.Sci.USA，84:7413-7417)。但是，毒性、细胞类型特异性的摄取和更重要的有限 待运物包装能力会对待运物尺寸和可转移的细胞类型产生显著约束（LuoandSaltzman, 出处同上）。
[0005] 物理转移方法包括：电穿孔（Chu,etal(1987)NucleicAcids Res. 15:1311-1326)和声致穿孔（Mitragotri(2005)Nat.Rev.DrugDiscovery, 4:255-260) (它们产生随机分布的纳米级微孔），以及光穿孔（TirlapurandKonig(2002) Nature, 418:290-291 ；Vogel,etal(2005)Appl.Phys.B:LaserOpt. , 81:1015-1047；Clark etal(2006)J.Biomed.Opt.，11:014034)(其在激光焦点处在细胞膜上产生微孔）。穿过 这些微孔，通过热扩散或通过电场将小待运物递送进细胞中。用这些方法递送大待运物的 效率较低，因为待运物扩散的速度较慢和细胞存活力随着孔径增大而下降（Stevensonet al(2006)0pt.Express, 14:7125-7133)。微毛细管注射（King(2004)MethodsinMolecular Biology245:GeneDeliverytoMammalianCells1；HumanaPressInc. :Totowa,NJ) 使用尖锐的移液管尖部机械地穿透细胞膜进行递送。但是，为了维持细胞存活力，由膜穿 透造成的机械创伤将典型的移液管尖部限制为0. 5um直径（Hanetal(2998)J.Nanomed. Nanotechnol.Biol.Med. , 4:215-225)〇
[0006] 由于移液管堵塞和待运物剪切，不可注射大于移液管尖部的待运物。电注射 (其组合了电穿孔和微毛细管注射）已经证实了向活细胞中的小分子（诸如RNA和质粒 DNA)递送（Boudesetal(208)J.Neurosci.Meth.，170:204-211;Kitamuraetal(2008) Nat.Meth.，5:61-67)和向人工脂囊泡中的细菌递送（Hurtigand0rwar(2008)Soft Matter, 4:1515-1520)，其中通过使细胞膜与电场接触进行弱化，然后轻轻地机械穿透进细 胞中。可替换地，简单的脂质辅助的显微注射（SLAM)技术（LaffafianandHallett(1998) Biophys.J. ,75:2558-2563)将合成的脂质分子整合在玻璃微毛细管的尖部。SLAM微量移 液管与细胞膜的接触允许脂质分子与细胞膜融合以形成连续的且暂时的待运物递送通路。 该方法避免了微量移液管尖部穿过细胞膜的曲折刺穿运动。但是，与待运物和细胞膜的亲 脂相互作用可以产生在细胞中的以及与递送待运物的不希望的生物学效应，从而将该方法 限于特定细胞类型和待运物含量。
[0007] 发明概述
[0008] 在某些实施方案中，本发明提供了一种细胞手术工具，其可以在显著减小对细胞 的损伤或应激下实现细胞的非常局部的穿透。在某些实施方案中，提供了一种细胞显微手 术工具，其中所述工具包含微毛细管（例如，微量移液管），所述微毛细管在尖部处和/或尖 部附近具有可通过施加电磁能而被加热的金属膜或多个纳米颗粒。
[0009] 在某些实施方案中，提供了一种细胞显微手术工具。通常，所述工具包含微毛细 管，所述微毛细管在尖部处和/或尖部附近具有可通过施加电磁能而被加热的金属膜或多 个纳米颗粒。在某些实施方案中，所述微毛细管包含中空腔。在某些实施方案中，所述微 毛细管的尖部的直径范围为约0. 01ym、0. 05ym、0. 1ym或0. 5ym至约1ym、3ym、5ym、 8ym或10ym。在某些实施方案中，所述微量移液管具有在约0. 5至约2ym或3ym范围 内的0D。在不同的实施方案中，所述纳米颗粒的尺寸范围为约50nm至约500nm。在不同的 实施方案中，所述纳米颗粒的尺寸范围为约l〇nm至约500nm。在不同的实施方案中，所述纳 米颗粒选自：纳米珠、纳米线、纳米管、纳米点、纳米锥和量子点。在不同的实施方案中，所述 金属膜或纳米颗粒包含贵金属、贵金属合金、贵金属氮化物和/或贵金属氧化物。在不同的 实施方案中，所述金属膜或纳米颗粒包含过渡金属、过渡金属合金、过渡金属氮化物和/或 过渡金属氧化物。在不同的实施方案中，所述金属膜或纳米颗粒包含磁性的、顺磁的或超顺 磁性的材料。在不同的实施方案中，所述微毛细管包含选自玻璃、矿物、陶瓷和塑料的材料。 在某些实施方案中，所述微毛细管包括在尖部附近具有纳米颗粒的玻璃微毛细管。在某些 实施方案中，所述微毛细管包括在尖部附近具有金纳米颗粒的玻璃微毛细管。在某些实施 方案中，所述微毛细管包括这样的玻璃微毛细管：其中所述纳米颗粒主要位于所述微毛细 管的尖部的100ym内。
[0010] 还提供了一种对细胞进行显微操作的方法。所述方法通常包括：使所述细胞接触 如本文中所述的显微手术工具；和对所述工具施加电磁能，由此增加金属膜或金属纳米颗 粒的温度，从而促进所述工具穿透进入或穿过细胞膜。在某些实施方案中，所述施加电磁能 包括：施加光以加热金属膜或纳米颗粒。在某些实施方案中，所述施加电磁能包括：施加激 光束以加热金属膜或纳米颗粒。尽管激光加热通常是优选的，还考虑其它电磁源。因此，在 某些实施方案中，所述施加电磁能包括：施加磁场以加热金属膜或纳米颗粒。在某些实施方 案中，所述施加电磁能包括：施加电场以加热金属膜或纳米颗粒。在不同的实施方案中，金 属膜或金属纳米颗粒的温度比环境温度增加了至少100、150、200、250、300或350摄氏度。 在某些实施方案中，所述方法进一步包括：穿过微毛细管将物质注射进细胞中。在某些实施 方案中，所述方法进一步包括：穿过微毛细管从细胞取出物质。在某些实施方案中，所述微 毛细管包含中空腔。在某些实施方案中，所述微毛细管的尖部的直径范围为约〇.lym至约 5ym。在某些实施方案中，所述纳米颗粒的尺寸范围为约5nm至约500nm和/或约10nm至 约400nm。在某些实施方案中，所述纳米颗粒选自：纳米线、纳米管、纳米点、纳米锥和量子 点。在不同的实施方案中，所述金属膜或纳米颗粒包含贵金属、贵金属合金、贵金属氮化物 和贵金属氧化物。在不同的实施方案中，所述金属膜或纳米颗粒包含过渡金属、过渡金属合 金、过渡金属氮化物和过渡金属氧化物。在不同的实施方案中，所述金属膜或纳米颗粒包含 磁性的、顺磁的或超顺磁性的材料。在某些实施方案中，所述微毛细管包含选自玻璃、矿物 (例如，石英）、陶瓷和塑料（例如，聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、DELRIN?、TEFLON? 等）的材料。在某些实施方案中，所述微毛细管包括在尖部附近具有纳米颗粒的玻璃或石 英微毛细管。在某些实施方案中，所述微毛细管包括在尖部附近具有金纳米颗粒的玻璃微 毛细管。在某些实施方案中，所述微毛细管包括这样的玻璃微毛细管：其中所述纳米颗粒主 要位于所述微毛细管的尖部的100ym内。
[0011] 还提供了一种用于对细胞进行显微手术的系统，所述系统包含如本文中所述的显 微手术工具和用于定位所述显微手术工具的显微操纵器（显微定位器）。在某些实施方案 中，所述系统进一步包含显微镜，其用于显现通过显微手术工具操作的细胞。在某些实施方 案中，所述系统进一步包含栗，其用于使用显微手术工具递送或取出试剂（例如，分子、细 胞器或流体）。在某些实施方案中，所述系统进一步包含电磁能源（例如，激光），其用于激 发在显微手术工具上的颗粒/纳米颗粒和/或薄膜。在不同的实施方案中，所述电磁能源 选自磁场发生器、激光、射频场发生器等。
[0012] 在不同的实施方案中，本发明提供了制备用于对细胞进行显微手术的工具的方 法。所述方法通常包括：在微毛细管的尖部处或附近，向微毛细管连接多个纳米颗粒，由此 提供可通过向纳米颗粒施加电磁能而被局部加热的装置。在某些实施方案中，所述连接包 括：将纳米颗粒吸附至微毛细管。在某些实施方案中，所述连接包括：在微毛细管上原位制 造纳米颗粒。在某些实施方案中，所述连接包括：将纳米颗粒化学偶联至微毛细管。
[0013] 在某些实施方案中，本发明的单细胞手术工具包括原子力测量（AFM)尖部。例如， 可以将纳米颗粒与用于细胞手术应用的AFM尖部集成到一起。该纳米颗粒集成的AFM尖部 可以通过扫描尖部和用激光脉冲它而在细胞膜上切出任何希望的形状。
[0014] 在某些其它实施方案中，本发明的工具明确地排除原子力测量（AFM)尖部。
[0015] 还提供了用于将试剂递送进细胞中的装置（转染装置）。在不同的实施方案中，所 述装置包含承载颗粒和/或纳米颗粒和/或膜（例如，薄膜）的表面（例如，转染衬底），其 中所述颗粒/纳米颗粒和/或薄膜包含当暴露（例如，受照射）于能源（例如，电磁辐射诸 如激光）时会升温的材料。可以将细胞布置在表面上或附近，且当所述颗粒/纳米颗粒和 /或薄膜被加热时，在细胞中形成开口（例如，细胞膜被透化），从而允许不同试剂向细胞中 引入或从细胞中取出。在某些实施方案中，所述表面包括容器（例如，细胞培养容器、微量 滴定板、微流体装置中的腔室等）的表面。在某些实施方案中，所述表面包含微量滴定板中 的孔的壁和/或底、硅或玻璃晶片、显微镜载玻片、细胞培养容器或在微流体装置中的腔室 或通道。在某些实施方案中，所述表面包括被构造成含有细胞且被设置成用于显微镜观察 的腔室表面。在某些实施方案中，所述表面包括被构造成替代显微镜（例如，倒置显微镜） 上的载物台的腔室表面。在某些实施方案中，所述腔室具有开放顶部，而在其它实施方案 中，所述腔室的顶部是封闭的。在某些实施方案中，所述表面包含选自玻璃、矿物和塑料的 材料。在某些实施方案中，所述表面包含选自II族材料、III族材料、IV族材料、V族材料 和/或VI族材料的材料。在某些实施方案中，所述表面包含IV族材料（例如，硅、锗等）。
[0016] 在不同的实施方案中，所述表面包含一个或多个孔。在某些实施方案中，所述纳米 颗粒和/或薄膜被沉积在孔表面上或孔附近。在某些实施方案中，所述表面包含至少2个 孔、或至少3个孔、或至少4个孔、或至少5个孔、或至少8个孔、或至少10个孔、或至少15 个孔、或至少20个孔、或至少25个孔、或至少30个孔、或至少40个孔、或至少50个孔、或 至少75个孔、或至少100个孔、或至少200个孔、或至少300个孔、或至少500个孔。在某 些实施方案中，所述孔都位于所述表面的约2cm2或更小、或约lcm2或更小的区域内，或在约 0. 5cm2或更小的区域内，或在约0.lcm2或更小的区域内。在某些实施方案中，所述纳米颗粒 和/或薄膜被设置在所述孔的约100ym内、或约50ym内、或约25ym内、或约20ym内、或 约15ym内、或约10ym内、或约5ym内。在某些实施方案中，所述颗粒/纳米颗粒和/或 薄膜被沉积在多个孔的表面上和/或多个孔附近。在某些实施方案中，所述颗粒/纳米颗粒 和/或薄膜被沉积在大多数孔的表面上和/或大多数孔附近。在某些实施方案中，所述颗粒 /纳米颗粒和/或薄膜被沉积在基本上所有孔的表面上和/或基本上所有孔附近。在某些 实施方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜被沉积在孔的壁上和/或都在孔的边缘周围。在某 些实施方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜优选是在孔的壁或边缘的一个区域上。在某些实 施方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜被沉积在表面的正面上和/或孔的边缘上，所述正面和 /或边缘在设置细胞的一侧的同侧。在某些实施方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜被沉积在 表面的正面上和/或孔的边缘上，所述正面和/或边缘在设置细胞的一侧的对侧。在某些实 施方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜包括薄膜。在某些实施方案中，所述纳米颗粒和/或薄 膜包括纳米颗粒，且所述纳米颗粒的尺寸范围为约5nm至约500nm。在某些实施方案中，所 述纳米颗粒的尺寸范围为约2nm、或约5nm、或约10nm、或约15nm、或约20nm至约400nm、或 至约300nm、或至约250nm、或至约200nm、或至约150nm、或至约lOOnm、或至约75nm、或至约 50nm。在某些实施方案中，所述纳米颗粒选自：纳米珠或纳米球、纳米线、纳米管、纳米点、纳 米锥和量子点。在某些实施方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜包含选自半导体、金属、金属 合金、金属氮化物和金属氧化物的材料。在某些实施方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜包含 选自过渡金属、过渡金属合金、过渡金属氮化物和过渡金属氧化物的材料。在某些实施方案 中，所述纳米颗粒和/或薄膜包含选自金、钛（Ti)、TiN、TiCn和TiAIN的材料。在某些实施 方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜包含掺杂有III族材料或V族材料的IV族材料（例如， 硅、锗等）。在某些实施方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜包含掺杂有选自硼、砷、磷或镓的 材料的硅或锗。在某些实施方案中，一个或多个孔与腔室流体连通，所述腔室含有要递送进 细胞中的试剂。在某些实施方案中，所述装置包含微通道，且一个或多个孔与所述微通道流 体连通。在某些实施方案中，所述装置包含多个微通道。在某些实施方案中，不同的微通道 与不同的孔流体连通。在某些实施方案中，所述装置包含歧管和/或阀以向不同的微通道 递送流体。在某些实施方案中，所述微通道含有要递送进所述细胞中的试剂。在某些实施 方案中，所述试剂选自：核酸、核酶、蛋白或肽、酶、抗体、细胞器、染色体、病原体和微粒或纳 米颗粒。在某些实施方案中，所述微通道（或腔室）被增压，在栗控制下，通过重力进料而 补料，或连接电动栗。在某些实施方案中，所述装置进一步包含控制器，所述控制器监测和 /或控制所述微通道中的流动，并控制定时，且任选地控制所述表面的照射位置。在某些实 施方案中，所述装置被构造成替代倒置显微镜上的载物台。在不同的实施方案中，将一个或 多个细胞设置在表面上，且在某些实施方案中，将细胞设置在衬底中的孔的表面上或附近。 在某些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞（例如，人细胞、非人哺乳动物细胞）。在某些 实施方案中，所述细胞是干细胞（例如，胎儿干细胞、脐带血干细胞、成体干细胞、诱导的多 能干细胞（IPSC)等）。
[0017] 在某些实施方案中，提供了用于在一个细胞或一组细胞中选择性地产生开口的系 统。在某些实施方案中，所述系统是用于将试剂选择性地递送进细胞中的系统。所述系统 通常包含：含有转染衬底的装置（例如，如上所述），和能够加热纳米颗粒或薄膜的电磁能 源。在某些实施方案中，所述电磁能源是激光或非相干光源。在某些实施方案中，所述电磁 能源是激光。在某些实施方案中，所述系统包含透镜系统、镜系统、或罩板和/或定位系统， 以将电磁能导向表面的特定区域。在某些实施方案中，所述系统包含控制器，其控制电磁辐 射源的照射的定时和/或模式。
[0018] 在某些实施方案中，提供了用于在一个细胞或一组细胞中选择性地产生开口的方 法。在某些实施方案中，所述方法可以用于将一种试剂（或多种试剂）选择性地递送进细 胞中。在不同的实施方案中，所述方法利用转染衬底和/或系统（例如，如上所述）。因 此，在某些实施方案中，提供了一种将试剂递送进细胞中的方法。所述方法包括：将细胞提 供在包含转染衬底的装置（例如，如上所述）上和/或在包含用于转染细胞的装置的系统 (例如，如上所述）中，其中将所述细胞设置在表面（转染衬底）上；使所述细胞与试剂接 触；和将所述表面的一个区域暴露于电磁辐射，由此诱导薄膜和/或颗粒的加热，其中所述 加热会形成气泡，所述气泡在被加热的区域（或附近）的细胞的膜中产生开口，从而导致所 述试剂向那些细胞中的递送。在某些实施方案中，通过将试剂提供在包围细胞的流体（例 如，缓冲液、培养基）中，使所述细胞与所述试剂接触。在某些实施方案中，通过将试剂提供 在存在于所述表面中的一个或多个孔中，使所述细胞与所述试剂接触。在某些实施方案中， 通过将试剂提供在一个或多个与所述孔流体连通的微流体通道中，使所述细胞与所述试剂 接触。在某些实施方案中，将不同的试剂递送至不同的孔。在某些实施方案中，所述暴露包 括：将所述衬底的一个区域暴露于激光脉冲或非相干光源。在某些实施方案中，所述试剂选 自：核酸、染色体、蛋白、标记、细胞器和小有机分子。
[0019] 在某些实施方案中，提供了对细胞进行显微操作的方法，所述方法利用微毛细管 的尖部作为光导引件和/或调节在所述尖部处的热分布。在某些实施方案中，所述方法包 括，使细胞接触显微手术工具，所述工具包含在尖部处和/或尖部附近具有金属膜（涂层） 或金属纳米颗粒的微毛细管，所述金属膜（涂层）或金属纳米颗粒可以通过施加电磁能而 被加热；给所述工具施加电磁能，由此增加金属膜或金属纳米颗粒的温度，从而导致在细胞 膜中形成开口，其中改变所述显微手术工具与所述细胞的接触角和/或电磁能的偏振，以 改变在细胞中产生的开口的大小和/或形状。在某些实施方案中，所述施加电磁能包括：施 加光（例如激光或非相干光）以加热金属膜或纳米颗粒。在某些实施方案中，所述显微手 术工具的尖部被构造成充当光导引件。在某些实施方案中，所述施加电磁能包括：施加激光 束以加热金属膜或纳米颗粒。在某些实施方案中，所述施加电磁能包括：施加电场和/或 磁场以加热金属膜或纳米颗粒。在某些实施方案中，所述金属膜或金属纳米颗粒的温度比 环境温度增加了至少150°c。在某些实施方案中，所述方法进一步包括：穿过微毛细管，将 试剂注射进细胞中。在某些实施方案中，所述微毛细管的尖部的直径范围为约〇.lym至约 5ym。在某些实施方案中，所述纳米颗粒的尺寸范围为约5nm至约500nm。在某些实施方案 中，所述金属膜或纳米颗粒包含半导体或选自以下的金属：贵金属、贵金属合金、贵金属氮 化物和贵金属氧化物。在某些实施方案中，所述金属涂层或纳米颗粒包含过渡金属、过渡金 属合金、过渡金属氮化物和过渡金属氧化物。在某些实施方案中，所述金属涂层或纳米颗粒 包含选自金、钛（Ti)、TiN、TiCn和TiAIN的材料。在某些实施方案中，所述微毛细管包含选 自玻璃、矿物、陶瓷和塑料的材料。在某些实施方案中，所述纳米颗粒或金属膜包含膜。在 某些实施方案中，所述纳米颗粒或金属膜包含纳米颗粒。
[0020] 定义
[0021] 本文中使用的术语"纳米颗粒"表示这样的颗粒：其具有等于或小于约800nm或 700nm或600nm或500nm、优选地等于或小于约200nm或150nm或100nm、更优选地等于或小 于约50或20nm的平均尺寸的至少一种尺寸，或具有约10nm或更小的微晶尺寸，所述微晶 尺寸从电子显微镜图像和/或标准2-0x-射线衍射扫描的衍射峰半宽度测得。在某些实 施方案中，优选地，尺寸分布的第一标准差是平均颗粒尺寸的60 %或更小、优选地40 %或 更小、最优选地15-30%。
[0022] 关于纳米颗粒尺寸的短语"尺寸范围"指示，纳米颗粒主要是在该尺寸范围内。 因而，例如，在某些实施方案中，至少85%、优选至少90%、更优选至少95%和最优选至少 98 %、99 %、或甚至所有的纳米颗粒是在所述的尺寸范围内。
[0023] 术语"过渡金属"通常表示，在周期表的d-块中的任意元素，不包括锌、镉和汞。这 对应于周期表上的3-12族。
[0024] 术语"微毛细管"和"微量移液管"互换使用。"微毛细管"是这样的管：其尖部具 有小于约50ym、优选地小于约25ym、更优选地小于约15ym或10ym和最优选地小于约 5ym的直径。在某些实施方案中，所述微毛细管具有约2ym或更小的尖部直径。在某些实 施方案中，所述微毛细管可以是固体杆。在某些实施方案中，所述微毛细管可以用具有更大 尖部直径（例如，大于约200nm，如本文中所述）的移液管（毛细管）替代。
[0025] 术语"核酸"或"寡核苷酸"或语法等效词在本文中表示至少2个共价地连接 在一起的核苷酸。本发明的核酸优选是单链的或双链的，且通常含有磷酸二酯键，尽管 在某些情况下（如下所述），包括可能具有替代性主链的核酸类似物，所述替代主链包 含例如：磷酰胺（Beaucageetal(1993)Tetrahedron49(10) :1925 和其中的参考文献； Letsinger(1970)J.Org.Chem. 35:3800；Sprinzletal(1977)Eur.J.Biochem. 81:579 ； Letsingeretal(1986)