一种可表达gfp的生防菌株fz01-gfp在靶标害虫流行病学中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农作物害虫病原真菌流行病学研究领域，特别涉及一种可表达GFP的 生防菌株玫烟色拟青霉FZ01-GFP在靶标害虫流行病学中的应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，我国对农业有害生物的生物防治给以了极大的重视。但目前关于生防菌 的基础研究比较薄弱，特别是对靶标害虫病原性真菌的流行病研究还缺乏有效合理的技术 手段，这严重阻碍了生防菌的利用和发展。
[0003] 玫烟色拟青霉（Paecilomycesfumosoroseus)属于半知菌纲，壳霉目、杯霉科。其 地理分布广泛，昆虫寄主多样，是蚜虫、粉虱等重要害虫的致病真菌。在自然条件下，可在 蔬菜、水果和园林植物等的靶标害虫种群中形成流行病。如在我国南方地区蔬菜植物上的 烟粉虱种群中可大面积地持续流行、能有效地控制烟粉虱种群的危害。在国外玫烟色拟青 霉已被开发为商品用于防治烟粉虱。然而，关于该生防菌对靶标害虫的侵染和流行病学研 究还是空白，最主要的就是无法简便、有效进行害虫病因的鉴别，特别是针对该属中某一特 定菌株的流行规律与控制评价，目前还缺乏快捷、可靠的技术进行大规模检测应用。
【发明内容】
[0004] 本发明目的是针对目前温室害虫病原真菌流行病学研究中，现有技术无法对靶标 害虫致死病因进行有效、快捷、可靠鉴别分析，特别是对生防菌某一特定菌株的流行规律和 防控效果评价缺乏可实施的简单方法，提出了一种可表达GFP(绿色荧光蛋白）的FZ01-GFP 生防菌株及其应用。
[0005] 本发明具体的技术方案如下：
[0006] 本发明提供一种可表达GFP的生防菌株FZ01-GFP，该生防菌株为采用原生质体的 遗传转化方法，将带有绿色荧光蛋白标记的表达质粒载体PCT74-GFP转入玫烟色拟青霉菌 株FZ01基因组中，获得可表达GFP的生防菌株FZ01-GFP。
[0007] 本发明还包括上述生防菌株FZ01-GFP在靶标害虫流行病学中的应用，具体过程 包括：
[0008] 释放所述FZ01-GFP生防菌株，定时定点采集、记录祀标害虫数量，并收集罹病害 虫样本，通过质粒载体PCT74-GFP的一对特异引物对罹病样本进行PCR分子检测鉴别，分析 数据，确定靶标害虫发生规律和生防菌FZ01-GFP流行趋势。
[0009] 其中，定时定点采集、记录靶标害虫数量，并收集罹病害虫样本的具体步骤为：
[0010] 每处理固定5点，每点连续调查3株，总计15株番前，在早晨成虫不大活动时，检 查每植株3片叶片的背面，每周固定同一天调查虫口情况，记录靶标害虫数量，收集罹病害 虫样本；
[0011] 优选的，在本发明中，对罹病样本进行PCR分子检测的特异引物如SEQIDN0. 1-2 所示：
[0012] SEQIDNO. -TAGTGGACTGATTGGAATGCATGGAGGAGT-3r ；
[0013] SEQIDNO. 2 :5' -GATAGAACCCATGGCCTATATTCATTCAAT-3'。
[0014] 本发明中，PCR分子检测鉴别的具体步骤包括：
[0015] (1)单头样品DNA提取；
[0016] (2)PCR扩增：PCR反应体系20yl，包括2.Oyl10XPCR反应缓冲液，各0. 5yl 10ymol/L所述引物，和2y1模板DNA，ddH20补足20y1 ;PCR反应条件为：94°C预变性 2min;94°C变性 30sec，53°C退火 30sec，72°C延伸 40sec，共 33 个循环；72°C延伸 5min;
[0017] (3)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上检测并拍照，根据扩增产 物的有无和片段大小判定结果，进一步鉴定致死病因。
[0018] 具体地，鉴定致死病因的标准为：特异性地扩增出417bp条带时，判断靶标害虫病 因为FZ01-GFP生防菌株侵染致死，无417bp条带则判断为非FZ01-GFP生防菌侵染。
[0019] 本发明的关键性技术是采用原生质体遗传转化方法，将表达载体PCT74-GFP转入 玫烟色拟青霉菌株FZ01基因组中，获得了一株可表达绿色荧光蛋白的菌株（FZ01-GFP)。在 温室内通过特定时间进行菌株释放，经科学的采样方法，并以质粒特异引物对罹病样本病 因是否由FZ01-GFP菌株侵染所致可进行大规模的PCR分子检测鉴别，结果快捷、可靠。本发 明以2014年室内玫烟色拟青霉菌FZ01-GFP侵染试验所采集的烟粉虱50份罹病样本为供 试材料，对害虫病因是否为FZ01-GFP菌株侵染引起进行分析，按上述PCR体系和鉴定方法， 结果都能特异性地扩增出417bp目的条带，证实该方法可用于玫烟色拟青霉流行病学研究 中快速可靠的检测和鉴定。
[0020] 本发明方法适用于玫烟色拟青霉流行病学研究中大量靶标害虫病因的快速鉴别， 对于生物防治中生防菌的流行病学研究和防控效果评价具有重要的实用价值。也可应用于 生防菌侵染机制、毒力效价评估、田间调查，为防治策略的制定提供科学依据。本发明与现 有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：
[0021] 1、特异性强，可靠性高：本发明分子PCR检测引物是以转化pCT74-GFP质粒为模 板，特异性强。已经对50个样本鉴定验证，结果证实所设计的两对引物特异性强，灵敏度 高，样品DNA含量lpg以上即可检测出。
[0022] 2、简便快速，实用性强：应用本发明方法对烟粉虱DNA提取、PCR扩增和琼脂糖电 泳后即可判定结果，一般100个样品整个检测过程可在4小时内完成。本方法可满足大量 样品快速检测的需要。
[0023] 3、适应性广、费用不高：本发明也可应用于侵染机制、毒力效价评估、田间调查等 领域。
【附图说明】
[0024] 图1玫烟色拟青霉FZ01在不同浓度潮霉素PDA生长情况；
[0025] 图2玫烟色拟青霉FZ01原生质体形态；
[0026] 图3玫烟色拟青霉FZ01-GFP孢子在光学显微镜（左）和荧光显微镜（右）的对 照图片；
[0027] 图4玫烟色拟青霉FZ01-GFP菌丝在荧光显微镜的特征图片；
[0028] 图5玫烟色拟青霉FZ01-GFP转化子基因组DNA扩增图，用质粒特异引物扩增出目 的片段在1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中：M为100bpDNAmarker;417bp为目的条 带；
[0029] 图6GFP转化后玫烟色拟青霉（FZ01-GFP)侵染烟粉虱结果；
[0030] 图7单季西红柿大棚玫烟色拟青霉FZ01-GFP对靶标害虫烟粉虱的流行趋势；
[0031] 图8为不同浓度样品DNA的PCR检测扩增图；其中1-6DNA浓度分别为每微升分别 为 10,1，0. 1，0. 01，0. 001，0.OOOlng;
[0032] 图9为部分烟粉虱罹病样品PCR扩增检测结果。
【具体实施方式】
[0033] 下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地 描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施 例，都属于本发明保护的范围。
[0034] 实施例1:玫烟色拟青霉菌株FZ01的GFP转化
[0035] 1材料：
[0036] 1. 1菌株和质粒
[0037] 玫烟色拟青霉FZ01由本研究室2013年在福州东郊从野外烟粉虱罹病体内经 分离获得并保存。质粒PCT74-GFP由福建省农科院资源所惠赠，含有真菌Pyrenophora triticireperttis的ToxA启动子和潮霉素B磷酸转移酶基因（hygr)。
[0038] 1. 2培养基、试剂和酶
[0039] 1. 2. 1培养基LB培养基：酵母提取物5g、蛋白胨10g、NaC15g、琼脂15g、水1000mL、 pH7. 0 ;PDB培养基：马铃薯200g、蔗糖20g，水1000mL;PDA:马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂粉 15g、水1000mL;再生半固体培养基：马铃薯200g、山梨醇182g、琼脂9g、水1000mL。
[0040] 1. 2. 2酶制剂崩溃酶（Drislase，购自Sigma公司），溶壁酶（LysingEnzyme，购自 广东微生物所）。
[0041] 1. 2. 3 稳渗剂 0? 8mol?LWaCl，山梨醇溶液：STC，含 1. 2mol?L1山梨 醇、lOmmol?LiTris-HCUpHT.ShSOmmol?LiCaCl〗，PTC溶液：40 %PEG4000、 lOmmol?L'Tris-HCl(PH7.5)、50mmol?iCaCl"
[0042] 1. 2. 4 抗生素氨节青霉素（Ampicillin，Amp)，潮霉素B(hygromycinB，HmB)。
[0043]1. 3菌株对潮霉素B(HmB)的敏感性测定
[0044] 将菌丝分别接种到含有不同浓度（Oug?mL\50ug?mL\lOOug?mL\u、 200ug.mL\250ug.mL4潮霉素B的PDA培养基上，28°C培养6d，观察菌丝的生长状态，以 确定抗生素的最低抑菌浓度，为转化后的原生质体培养提供合适的潮霉素B浓度。
[0045] 1. 4质粒的提取
[0046] 从LB平板中挑取活化培养24h的质粒pCT74的单菌落到含有50ugmL1氨苄青霉 素抗生素的LB液体培养基，于37°C、300r?min1过夜培养。质粒DNA提取方法按Plasmid MiniKit(QIAGEN)试剂盒的操作步骤进行。
[0047] 1. 5原生质体制备
[0048] 从培养皿上挑取孢子制成浓度约为1X107cfu?L1孢子悬浮液，取l_2mL到H)B 培养基三角瓶中，28°C、150r1摇床培养24-36h。培养液经3层擦镜纸过滤收集菌丝， 0? 8mol?LWaCl充分洗涤。取200-400mg菌丝体加5-10mL裂解液（包含20mg?mL1崩溃 酶和20mg?mL1溶壁酶，酶液用冷的的NaCl配置，28°C、轻微振动溶解30min，用0. 22pm的 微孔过滤器过滤），28°C消化2-3h。用3层擦镜纸集滤液，室温3000r?min1离心lOmin， 弃上清液加10mLSTC溶液5000r?min1离心lOmin，弃上清用lmLSTC溶解转入2mL离心 管中，室温3500r?min1重复离心lOmin，调整原生质体浓度为10 7个?mLi。
[0049] 1. 6原生质体的转化
[0050] 取5ug质粒DNA与200uL原生质体在离心管中混勾，室温静置20min，加入lmL 40%?1^，轻轻混