一种取代脲类除草剂残留降解菌株及其生产的菌剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业微生物领域，涉及一种取代脲类除草剂残留降解菌株及其生产的 菌剂。 技术背景
[0002] 化学农药的广泛使用大大地促进了现代农业的发展，为农业生产挽回了大量因病 虫草害等原因造成的损失，并极大地提高了农业生产的劳动效率和机械化程度，在农业生 产的现代化进程中起了不可估量的作用。但同时农药都是一些有毒有害化学物质，它们进 入生态环境后，不仅杀死了对人类有害的生物，同时也对生态系统造成了严重的危害。农药 的大量使用引起农产品中农药残留超标，严重影响了人民的身体健康。随着人们生活水平 的提高和环境保护意识的增强，全社会对农药残留带来的直接危害和潜在影响亦愈来愈关 注，人们迫切需要无农药残留污染的清洁的绿色农产品。
[0003] 取代脲类除草剂已经被商业化生产超过50年，成为了全世界广泛使用的最重要 的除草剂之一。由于其广泛重复的使用以及相对较高的水溶性，在各种污染的生境和农副 产品中经常被检测到。全国每年发生多起农药中毒、甚至死亡的事故，七成与农药残留有 关。值得注意的是一些大市场卖出去的农副产品农药残留严重，直接危害城乡居民的身体 健康和生命安全，不少农产品生产基地因其产品中农药残留超标影响销售和出口。另外由 于部分农户的不规范使用，也造成了农药在环境中的广泛残留。因此农药残留已经成为食 品安全与生态环境保护中首当其冲、急待解决的问题。
[0004] 取代脲类除草剂本身及其代谢产物被证明对微生物、植物、动物、及人类都有毒害 作用。因此，取代脲类除草剂在环境中的吸附、迀移、和分解也备受关注。由于农药残留污 染一般属于面源污染，具有广泛性和顽固性，一般方法很难将其彻底清除。然而，实验室和 实际应用研究都表明利用微生物来降解消除土壤中的农药残留"库"容量，从而降低粮食、 蔬菜、茶叶等农产品中的农药残留，提高农产品的品质和经济价值是可行的。而且微生物数 量大、种类多，其降解有机物的潜力是相当大的，几乎所有能造成环境污染的有机物都能被 微生物所分解、利用，而且干净彻底、无二次污染。利用微生物的新陈代谢作用，对易残留的 农药进行转化，使其无毒化，也是目前研究的热点。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，筛选一株新的农药残留降 解菌。
[0006] 本发明的另一目的是提供该降解菌的应用。
[0007] 本发明的又一目的是提供该降解菌生产的菌剂。
[0008] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0009] 本发明提供一种高效降解取代脲类除草剂的菌株。该菌株是一株革兰氏染色反应 阴性菌LR2014-1，2015年04月15日寄存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC M2015236。经鉴定属于Diaphorobactersp.。菌株LR2014-1的形态学特征为：在LB平 板上呈淡黄色菌落，菌落凸起，表面湿润光滑，边缘整齐，不透明（图1A)。主要生物学特性 为：G_，菌体为杆状，大小约0. 7ym宽，1. 8ym长，无鞭毛（图1B)，好氧；过氧化氢酶、氧 化酶和V.P.反应为阳性；B引哚反应阴性；不能水解淀粉，氧化葡萄糖产酸，使石蕊牛乳酸凝 固。在利谷隆农药平板上能形成透明的降解圈（图1C)。菌株LR2014-1能将利谷隆、敌草 隆降解为3, 4-二氯苯胺。最适降解底物为利谷隆，在实验室摇瓶培养条件下利谷隆的降解 率达99%以上（图2)。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。
[0010] 本发明所述的取代脲类除草剂降解菌株LR2014-1在降解取代脲类除草剂中的应 用，优选在降解土壤中取代脲类除草剂中的应用。
[0011] 其中，所述的取代脲类除草剂优选利谷隆、敌草隆或绿麦隆，进一步优选利谷隆。
[0012] 本发明所述的取代脲类除草剂降解菌株LR2014-1在制备降解取代脲类除草剂的 降解菌剂中的应用，优选在制备降解土壤中取代脲类除草剂的降解菌剂中的应用。
[0013] 其中，所述的取代脲类除草剂优选利谷隆、敌草隆或绿麦隆，进一步优选利谷隆。
[0014] 一种用本发明所述的除草剂降解菌株LR2014 -1生产的取代脲类除草剂残留降解 菌剂。
[0015] 所述的降解菌剂优选通过以下工艺制备得到：斜面种一摇瓶种一种子罐一生产 罐一产品（包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂）。
[0016] 所述的降解菌剂进一步优选通过以下步骤制备得到：
[0017] 1)将取代脲类除草剂残留降解菌LR2014-1的试管种接种于LB培养基摇瓶中，振 荡培养至对数期；
[0018] 2)将上述培养好的菌种按10%的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长 期。种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖〇? 8 %，（NH4) 2S041 %，K2HP040 . 2 %，MgS040 . 05 %， 恥(：10.01%，〇&0)30.3%，酵母膏0.02%，口11值7.2-7.5。
[0019] 3)将种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养 基相同。
[0020] 在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1 :0. 6 - 1. 2,搅拌速度为 180 - 240转/分，培养温度为30°C，整个工艺流程培养时间为96 - 108小时。发酵完成 后培养液即为菌剂。
[0021] 本发明所述的取代脲类除草剂残留降解菌剂的制备方法，包括以下步骤：
[0022] 1)将取代脲类除草剂残留降解菌LR2014-1的试管种接种于LB培养基摇瓶中，振 荡培养至对数期；
[0023] 2)将上述培养好的菌种按10 % (v/v)的接种量接种入500升种子罐，培养至 对数生长期。种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖0.8%，（NH4)2S041%，K2HP040 . 2 %， MgS040 . 05%，NaCl0? 01%，CaC03 0? 3%，酵母膏 0? 02%，pH值7. 2-7. 5。"％"表示g/100ml。
[0024] 3)将种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养 基相同。
[0025] 在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1 :0. 6 - 1. 2,搅拌速度为 180 - 240转/分，培养温度为30°C，整个工艺流程培养时间为96 - 108小时。发酵完成 后培养液即为菌剂。
[0026] 有益效果
[0027] 本发明提供一株能够高效、快速降解取代脲类除草剂的细菌LR2014-1。降解菌 LR2014-1具有广泛的降解谱，能降解利谷隆、敌草隆、绿麦隆等取代脲类除草剂以及敌稗， 灭草灵，呋喃丹等农药。能在24小时内完全降解0.2mM的利谷隆。具有广泛的应用潜力和 价值。使用该细菌生产的降解菌剂具有生产使用成本低，使用方便，去除效果好的优点，适 合在全国粮油蔬菜生产出口基地或有绿色食品商标标志的地方大面积推广使用。本发明对 于保护生态环境，保护人民的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。使用该降解 菌剂可以在农作物播种前正常使用化学农药进行杂草防治而保证农产品中农药残留含量 符合绿色食品要求。
[0028] 本发明成功地解决了农业生产中农药残留超标问题，既充分发挥了化学农药在植 物病虫害防治中的高效快速的作用，又可以生产出无毒无公害的绿色农产品。
【附图说明】
[0029] 图1菌株LR2014-1的菌落照片（A)和电镜照片⑶以及在利谷隆农药平板上能 形成透明的降解圈（C)
[0030] 图2菌株LR2014-1对利谷隆的降解
[0031] 图3温度对降解菌LR2014-1降解利谷隆的影响
[0032] 图4初始pH对菌株LR2014-1降解利谷隆的影响
[0033] 图5接种量对菌株LR2014-1降解利谷隆的影响
[0034] 图6通气量对菌株LR2014-1降解利谷隆的影响
[0035] 图7菌株LR2014-1的底物谱紫外检测效果图
[0036]A菌株LR2014-1降解敌稗效果紫外检测图，B菌株LR2014-1降解灭草灵紫外检测 图，
[0037]C菌株LR2014-1降解绿麦隆紫外检测图，D菌株LR2014-1降解呋喃丹紫外检测 图，
[0038]E菌株LR2014-1降解敌草隆紫外检测图。
[0039] 生物材料保藏信息
[0040]LR2014-1，分类命名为Diaphorobactersp.LR2014-1，保藏于中国典型培养物保 藏中心，菌种保藏号为CCTCCM2015236,保藏日期为2015年04月15日，保藏地址为中国 武汉武汉大学。
【具体实施方式】
[0041] 实施例1、菌株的分离与鉴定
[0042] 本发明提供一种能高效降解取代脲类除草剂的菌株及其生产的菌剂，所用菌株为 革兰氏染色阴性菌LR2014-1，分离自江苏如东某农药厂厂区的土壤中。菌株具体的分离筛 选方法为：
[0043] 取土样5. 0g加入到100ml含有0. 2mM利谷隆的液体无机盐培养基（以下简称 MM)，30°C、150rpm摇床培养7d，以5%接种量（v/v)转接至新鲜的同一培养基中，连续富集 培养四次。将第五代富集液在含有〇. 2mM利谷隆的MM固体培养基上稀释涂布，30°C培养 5d，挑取平板上的单菌落于3ml液体LB试管培养基中，然后保存并转接至20mL含有0. 2mM利谷隆的MM培养基中，30°C培养5d，用等体积的二氯甲烷萃取，紫外分光光度计检测效果， 从而获得利谷隆降解菌株。
[0044] 2015年04月15日寄存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCCM 2015236,经鉴定属于Diaphorobactersp.。菌株LR2014-1的形态学特征为在LB平板上呈 淡黄色菌落，菌落凸起，表面湿润光滑，边缘整齐，不透明（图1A)。主要生物学特性为(T， 菌体为杆状，大小约〇. 7ym宽，1. 8ym长，无鞭毛（图1B)，好氧；过氧化氢酶、氧化酶和 V.P.反应为阳性；B引哚反应阴性；不能水解淀粉，氧化葡萄糖产酸，使石蕊牛乳酸凝固。在 利谷隆农药平板上能形成透明的降解圈（图1C)。将菌株LR2014-1的16SrRNA基因序列在 数据库EzBilCloud中比对分析，结果显示菌株LR2014-1与Diaphorobacter属亲缘关系最 近，其中与DiaphorobacternitroreducensNA10B1 相似性达 99. 93%，与Diaphorobacter oryzaeRF3T相似性达98. 50%。结合菌落形态特性、生理生化特征以及16SrRNA基因比 对分析，菌株LR2014-1初步鉴定为Diaphorobacter属。
[0045]实施例2、实验室降解实验
[0046] 2. 1种子液制备
[0047] 将菌株LR2014-1接入含0? 2mM利谷隆的100mLLB培养基中，30°C、150rpm摇床培 养，48h后6000rpm离心收集菌体，使用MM洗涤菌体两次，最后用10mLMM重悬，作为种子液 备用。
[0048] 2. 2菌株LR2014-1对除草剂利谷隆的降解
[0049] 将菌株LR2014-1按5%的接种量接至含有0. 2mM利谷隆的100mLMM中，30°C、 150rpm摇床培养，每隔3小时取样5mL，取至24小时。检测利谷隆残留量，