一株广谱抗植物致病真菌的芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及芽孢杆菌，尤其是涉及一株广谱抗植物致病真菌的芽孢杆菌及其在制 备防治植物致病真菌上的应用。
【背景技术】
[0002] 海洋拥有相当于陆地将近2. 5倍的面积，蕴藏着丰富的生物、化学资源。海洋生物 由于其生存于高渗、高盐、低温、高压、低氧等特殊环境，使其能够在生长和代谢过程中产生 各种具有特殊生理功能的活性物质（高小宁，陈金艳，黄丽丽，等.油菜菌核病内生拮抗 细菌的筛选及防病作用研究[J].农药学学报，2010 (2) : 7-10)。在这些海洋生物资源中，丰 富多样、新奇独特的海洋微生物是发现新材料、新功能、新基因、新机制的理想资源，近年来 从海洋微生物中不断发现具有生理意义的新的次级代谢产物，这类物质通常具有陆地微生 物所没有的新的独特结构（张傯，张长生，田新朋，等.中国海洋微生物多样性研究[J]. 中国科学院院刊，2010(6) : 651-658)。
[0003] 由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum)引起的油菜菌核病是油菜生产中的重要 病害，致油菜减产10 %~70 %，含油量降低1 %~5 %，严重影响油菜的产量和品质。喷 洒化学药剂仍是目前防治油菜菌核病最直接、简便的方法，同时也是最有效的防治方法。 但长期单一使用同种化学药剂，使病原菌对化学药剂产生抗药性，防效逐年下降。近年 来，人们逐渐将研究的重点转向了生物防治（Panlilio A L，Culver D H，Gaynes R P，et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in US hospitals, 1975 - 1991[J]. Infection Control, 1992, 13(10) :582-586)。生物农药对空气、水源、土壤和农作物的无污 染性，使其成为农业可持续发展的重要方向。
[0004] 已经报道的芽孢杆菌菌株对不同植物的病原真菌和细菌具有防治作用，如粮食作 物中的水稻纹枯病、稻瘟病、小麦纹枯病、豆类根腐病及小麦全蚀病等，蔬菜病害中的番茄 叶霉病、黄瓜枯萎病、黄瓜霜霉病、茄子灰霉病及辣椒疫病等（程亮，游春平，肖爱萍.拮 抗细菌的研究进展[J].江西农业大学学报，2004, 25 (5) : 732-737)。芽孢杆菌具有生长快、 营养简单、易分离培养、抗逆性强的特点（朱玥妍，刘姣，杜春梅.芽孢杆菌生物防治植物 病害研究进展[J].安徽农业科学，2013, 40 (34) : 16635-16638)，更符合现代社会对农业生 产及有害生物综合防治的需求。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一在于提供一株广谱抗植物致病真菌的芽孢杆菌（Bacillus sp.)DY26-014。
[0006] 本发明的目的之二在于提供所述广谱抗植物致病真菌的芽孢杆菌（Bacillus sp. ) DY26-014在制备防治植物致病真菌发酵上清液中的应用。
[0007] 所述芽孢杆菌（Bacillus sp.)DY26_014分离自中国大洋第26次科学考查所采集 的沉积泥样品（S003站点；w63° 45. 3496'，S3。39. 8693');该菌已于2015年6月27 日保藏于中国典型培养物保藏中心，中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大 学，邮编为430072,保藏中心保藏编号为CCTCC NO :M 2015408。
[0008] 所述芽孢杆菌（Bacillus sp.)DY26-014通过聚合酶链式反应（PCR)扩增其16S ri)NA序列，与美国国家生物技术信息中心（NCBI)GenBank数据库中相应的序列进行比对 分析，发现其与芽孢杆菌属（Bacillus sp.)具有99%的序列相似性；16S ri)NA序列的 GenBank 登录号为 KT270354。
[0009] 所述芽孢杆菌（Bacillus sp. )DY26_014的16S rDNA部分序列如下：
[0010] I TCAGAGCTTG C'TC，C(T^ SI TAAC(:TG(:CT OTAAGACTGG GAT八八CTCCW I () I GAT(.K.iTT(.iTC T(."VAC(、GCAT GGTTC八(::A 151 CACTTACAGA TGGACraK/G 201 CA(，CA ACKK，G ACGATGCGTA Ga M ：251 GGACTGAGAC ACGGCCCAGA CTCCmCGGG AGGCAGCAQT AGGGAAICTT 301 rC'GC、八AT(.K.;A C(.i八八八(.iTCTCi AC( AAGCAAC (f 351 TTTCCK-iATC'G T八八八(XTCTG爪 401 AG(.K;】a.K.K'AC CriX込C(.K.n'A CCTAACC'AG八八八(:（ 45] a 'A(XA(.K:、CG CG(.n7\ATAr(.r「A(.K.;T(.KX八八 501 G(:GTA八八CK又i CTCVjCA(-K:iCM 551 CTC八八CC(K(iA(.K.KTT CATT (K.i八八八CT(KG八八C'TT(.iA(.iT GCAGAAG八(.iG 601 AGAGTCK-L'AT TCCA(XiTGTA (S5I ACCAGTGGC'G八八GGCGAC'TC' TCTGCHCT(几
[0011] 701 AGCGTGGGGA GCQMCAGGA TmG^CCC TOGmGTCCA CGCCGmAAC 751 GAT(.L\(:,T(.K'_T八八(」TGTTA(.K.i GGGTTT(:TGC C(:TTT^ HOI GCATT八八GCA CTCCGCCRiCi C.iC.iAGTACGGT. C(.X 851 (^『I'CiACGG (.K.K.KXCGCAC、A A(.K:、 901 CA ACGCGA八(.；A ACCTTACCA G(iTCTT(x\rA T(XTCT(iAC八八TC('T八GAG八 951 TAGGA(X CCTTCG(.;(.K.K.KV\GA(.;TGA('八（iGTGGTGQ 1001 AGCTCXiTGTC' CiTGACiATGTT GGGTTAAGTC' C'CCiCAACGAC, CXiCAACC'CTT 1051 GATCTTACiTT GCCAGCATTC A(.iTT(.i(.K.;CAC TCTAAGGT(.iA CT(.iC'C(.i(几 11 () I CAAACCGGAG GAAGGTCiGGG AT(W 1151 CTGGGCTACA CACGTGCTAC八 1201 GAGGTT八八GC C、AATCC、CAC八八八lX、TC;m、T CA(汀TCGGAT CGCAGTCTCiC 1251 A ,\(:、T(:、GACT(j C(.】T(.;AAGC'TG GAATC(.K.:TA(.H.AATCGCCKj^^^ 1301 (XTK-'iTGAATA CGTTC(T(:>(:>(W 1351 A(jT'TT(iTAAC'AC'CT'GAAGTC' CiCiTGAC.K.n'A.
[0012] 所述芽孢杆菌（Bacillus sp.)DY26-014可在制备防治植物致病真菌发酵上清液 中的应用。
[0013] 所述植物致病真菌包括但不限于镰刀菌、香蕉炭疽菌、宛氏拟青霉、核盘菌、长柄 链格孢、绿色木霉、立枯丝核菌、互生链格孢、灰霉菌和胶孢炭疽菌。其对油菜菌核病菌（核 盘菌）具有较好的生物防治效果，在盆栽试验中，防效可达到61. 9%。
[0014] 所述防治植物致病真菌发酵上清液的使用方法可为：将防治植物致病真菌发酵上 清液直接喷洒在植物上即可用于致病真菌的防治。
[0015] 所述防治植物致病真菌发酵上清液的制备方法如下：
[0016] 将芽孢杆菌（Bacillus sp.)DY26-014接种至发酵培养基中摇床培养后，离心除去 菌体，即得防治植物致病真菌发酵上清液。
[0017] 所述芽孢杆菌（Bacillus sp.)DY26-014的接种量按质量百分比可为发酵培养基 的1 %~10%;所述摇床培养的条件可为：发酵培养基装液量为500mL/lL三角瓶，培养的温 度25~30°C，培养的时间48~72h，摇床转速为180~220r/min。
[0018] 所述发酵培养基的组成可为：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L， 121°C高灭压菌20min ;所述离心除去菌体的条件可在10000r/min下离心15~20min。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：芽孢杆菌（Bacillus sp.)DY26_014发酵 上清液的制备工艺简单，抑真菌谱广，对核盘菌生防效果好。
【附图说明】
[0020] 图1为芽抱杆菌（Bacillus sp.)DY26-014的菌落形态。
[0021] 图2为芽孢杆菌（Bacillus sp.)DY26-014发酵上清液对不同植物致病真菌的抑 菌效果图。在图2中：A :灰霉菌；B :宛氏拟青霉；C :核盘菌；D :绿色木霉；E :立枯丝核菌； F :长柄链格孢；G :胶孢炭疽菌；h :互生链格孢；I :镰刀菌；J :香蕉炭疽菌。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例对本发明作进一步描述。
[0023] 实施例1:芽孢杆菌（Bacillus sp. )DY26_014的分离筛选
[0024] 本发明涉及芽孢杆菌（Bacillus sp.)DY26-014来源于从中国第26次大洋科学考 查所采集的沉积泥样品中所分离获得。该菌在LB培养基上生长，28°C培养24h后，菌体呈 浅黄色，菌落较大，生长初期菌落呈水滴状，见图1。
[0025] 实施例2 :芽孢杆菌（Bacillus sp. )DY26_014菌种鉴定
[0026] 设计并合成16s rDNA基因的通用正向引物27F和通用反向引物1492R，