一种抗原致敏的树突状细胞的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗原致敏的树突状细胞的制备方法，属于细胞工程与生物医药技 术领域。
【背景技术】
[0002] 体细胞治疗是指应用人的自体、同种异体或异种（非人体）的体细胞，经体外操作 后回输（或植入）人体的治疗方法。这种体外操作包括细胞在体外的传代、扩增、筛选以及 药物或其他能改变细胞生物学行为的处理，经过体外操作后的体细胞可用于疾病的治疗， 也可用于疾病的诊断和预防。体细胞治疗具有多种不同的类型，包括体内回输体外激活的 单个核细胞如淋巴因子激活的杀伤细胞（Lymphokine Activated Killer Cells，LAK)、肿 瘤浸润性淋巴细胞（Tumor Infiltrative Lymphocytes，TIL)、单核细胞、巨细胞或体外 致敏的杀伤细胞（IVS)等。国内的免疫细胞治疗较多应用于治疗肿瘤及病毒性感染疾病如 肝炎、艾滋病等。目前临床中应用较为成熟的自体免疫细胞治疗技术是肿瘤生物治疗的重 要方法之一，是在多种免疫活性因子的作用下，有效活化和扩增从自体外周血中分离的免 疫活性细胞（单个核细胞），回输入患者体内，直接杀伤或诱导免疫效应细胞杀伤肿瘤细胞 或病毒感染细胞，或调节和增强机体的免疫功能。自体免疫细胞治疗技术包括细胞因子诱 导的杀伤细胞（Cytokine Induced Killer Cells，CIK)免疫治疗、树突状细胞（Dendritic Cells，DC)免疫治疗、DC-CIK细胞免疫治疗、自然杀伤细胞（Nature Killer，NK)免疫治疗 等。
[0003]树突状细胞（Dendritic Cells，DC)是 1973 年美国 Rockeflle 大学 Steinman 和 Cohn在观察脾脏细胞时发现的，因其成熟时有树突样或伪足样突起而得名。DC来源于造血 干细胞，广泛分布于淋巴组织和非淋巴组织中，是目前已知的功能最强的专职抗原提呈细 胞，其膜表面高表达MHC-II类分子，能有效刺激初始型T细胞活化，其抗原提呈能力远强于 巨噬细胞和B细胞。因此，DC是机体免疫应答的主要启动者，在肿瘤免疫中亦发挥关键作 用。国内外学者应用各种方法将DC进行处理，在体外扩增活化，并予以相应的抗原刺激以 制成DC疫苗，然后回输至患者体内进行免疫治疗。
[0004] 然而DC在体内的数量极少，难以满足临床治疗研究的需要，随着研究的深入，体 外诱导制备DC的技术取得了很大的进步，目前应用最为广泛的是用粒细胞-巨噬细胞集 落刺激因子（Granulocyte Macrophage Colony Stimulting Factor，GM-CSF)和白细胞介 素-4(1]^61'161^;[11-4，11-4)共同刺激单核细胞，使其分化为不成熟0(：并进一步分化为成 熟DC。也可用GM-CSF和肿瘤坏死因子-a (Tumor Necrosis Factor-a，TNF-a)与来源 于骨髓或外周血的⑶34+造血祖细胞共同培养，获得大量DC。
[0005] 体外培养DC的培养基可以用加有胎牛血清、人AB型血清或自身血清的完全培养 基，也可以使用无血清培养基进行无血清培养。血清在细胞培养中的作用主要包括：a.提 供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子或提供基础培养基所缺乏的营养物质；b.提 供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白，并通过与上述物质的结合而祈祷稳定和调 节上述物质活性的作用，此外结合蛋白还可消除某些毒素和金属对细胞的毒性作用；C.提 供贴壁细胞固着于适当的附着面所需的贴壁因子和扩展因子；d.提供蛋白酶抑制剂，使细 胞免受蛋白酶的损伤；e.提供pH缓冲物质，调节培养基pH ;f.影响培养基系统中的某些物 理特性如剪切力、粘度、渗透压和气体传递速率等。但是，血清中含有一些物质对细胞会产 生毒性作用，如多胺氧化酶能与来自高度繁殖细菌的多胺起反应形成有细胞毒作用的聚精 胺。此外，血清中的补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞的生长，甚至造成细胞死亡。胎牛 血清及人异体血清有外来抗原和感染的可能，易引起过敏反应，而且有MHC限制等。而自体 血清中可能存在的血管内皮衍化生长因子和白介素-10是DC分化、成熟的抑制剂，从而导 致使用自体血清培养DC产率低。上述使用血清进行DC扩增培养存在的问题大大限制了其 在肿瘤免疫治疗中的进一步应用，而相较而言，无血清培养基在基础培养基的基础上，引入 成分完全确定或部分明确的血清替代物，使培养基既能满足细胞生长的基本需求，又能有 效避免上述因为使用血清带来的诸多不利因素，因此无血清培养基诱导制备DC有着广阔 的临床应用前景。
[0006] 无血清培养过程中添加血清替代成分的方式有两种，一种是在新研发的无血清 培养基成分中已经包含了各种血清替代成分，可直接进行培养；另一种是单独提供血清替 代物，在培养时代替血清添加进入培养体系中，还需另行添加部分血清替代成分如生长因 子、激素等。用于DC培养的无血清培养基在国内外均有可商购的产品，以用于免疫细胞培 养的无血清培养基为例，进口产品有Sigma-Aldrich公司的StemlineTM Dendritic Cell Maturation Medium、R&D Systems公司的StemXVivoTM Serum-Free Dendritic Cell Base Media、CellGenix公司的CellGro GMP Serum-free Dendritic Cell Medium、Celprogen公 司的 Human dendritic Primary Cell Culture Serum Free Media、Lonza 公司的 X-vivo、 Gibco公司的A頂V培养基等，国内产品如百恩维的BW12002等。
[0007] 虽然无血清培养基具有许多传统的含血清培养基无法比拟的优势，但是其仍存在 以下的不足有待改善：a.细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培 养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便；b.针对性强，不同类型的细胞、甚至不同 细胞系或细胞株对培养基营养成分的需求都不同；c.使用无血清培养基进行原代细胞分 离时细胞得率偏低；d.细胞功能可能被改变导致细胞功能不全；e.目前大部分无血清培养 基所必需的胰岛素和转铁蛋白仍以动物为来源，并没有消除血清带来的安全隐患；f.成本 较高。
[0008] 为改善和解决上述问题，研究者们也在不断探索和改进免疫细胞无血清培养基的 配方，专利CN201110081988. 5提供了一种人源性无血清培养基，是由治疗用人血清白蛋 白、人重组胰岛素、人转铁蛋白、人胆固醇、人过氧化氢酶、2-巯基乙醇、抗坏血酸、亚油酸、 乙醇胺、人玻连蛋白、L-谷氨酰胺组成的，其所添加的蛋白质和脂类均来源于人的血浆、血 清或组织，为药物级或高度纯化的人源蛋白或人重组蛋白，不含动物源成分，该发明虽然避 免了动物源性物质的安全隐患，但是人源蛋白或人重组蛋白价格昂贵，不利于大规模推广 使用；专利CN201310082166. 8提供了一种化学成分明确、无动物源的用于淋巴细胞的培养 和增殖的无血清培养基，组成成分复杂，包含有頂EM基础培养基、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、 重组人胰岛素、人转铁蛋白、人血清白蛋白、2-巯基乙醇、N-乙酰-半胱氨酸、脂质、氨基酸、 微生物、微量元素、氢化可的松、乙醇胺、非必需氨基酸和柠檬酸铁。然而该产品仅适用于淋 巴细胞的培养增殖，而且使用的人重组蛋白或人源蛋白价格昂贵，在使用上具有很大的局 限性。
【发明内容】
[0009] 为解决上述问题，本发明提供了一种抗原致敏的树突状细胞（Dendritic Cells， DC)的制备方法。
[0010] 本发明的一个目的在于提供一种用于制备抗原致敏的DC的无血清替培养基，其 具有成分明确、无动物源性成分、蛋白成分含量低、不含转铁蛋白、不含粒细胞-巨噬细胞 集落刺激因子（GM-CSF)等特点。
[0011] 本发明的第二个目的在于提供一种利用本发明的培养基制备抗原致敏的DC的方 法。所述方法具有安全有效、简单易行、易于推广实践等优点，可通过本方法为临床提供特 异性治疗用途的DC疫苗。
[0012] 本发明的第一个目的是这样实现的：
[0013] 提供了一种用于制备抗原致敏的DC的无血清培养基，其特征在于：所述培养基由 基础培养基和其它成分组成。
[0014] 其中，所述其它