抗nse单克隆抗体产生的杂交瘤的制作方法
【专利说明】
【技术领域】
[0001]本发明涉及NSE单克隆抗体产生的杂交瘤。
[0002]【背景知识】
[0003]神经元特异性稀醇化酶(neuron specific enolase，NSE)由α、β和γ三个亚基组成的二聚体，其同工酶可分为€[(1、00、丫丫、€[0和€[丫五种。α亚基主要存在于肝、肾等组织；β亚基主要存在于骨骼肌和心肌；γ亚基主要存在于神经组织。γ γ、α γ组成的同工酶为神经元和神经内分泌细胞特有，故命名为神经元特异性烯醇化酶(NSE)或γ-酶。NSE是一种酸性蛋白酶，等电点为pH 4.7。NSE基因核苷酸序列全长2423bp，可读框从第226到1531个碱基，长度为1305bp，编码434个氨基酸残基，分子量为78kDa。NSE所有抗原决定簇都分布在48?96、188?293、399?433氨基酸序列区，位于其三维结构表面，在免疫反应中可刺激机体产生NSE的单克隆抗体，可用于NSE的检测。NSE是特异性地存在于神经元中，是烯醇化酶基因超家族成员之一，主要参与糖酵解，催化2-磷酸甘油酸变成磷酸烯醇式丙酮酸的关键酶。高浓度存在于神经细胞和神经内分泌细胞以及这些细胞所引发的肿瘤细胞中。肿瘤细胞糖酵解活性异常增高，而又有NSE的异常高表达，尤其在小细胞肺癌和神经母细胞瘤中。NSE在细胞被破坏时从细胞质内释放出来。因此血液循环中的NSE与神经内皮来源细胞的死亡数量相关，这也是NSE能作为相关神经内皮来源肿瘤标志物的原因。NSE在小细胞肺癌临床分期有很好的相关性，疗效监测和判断预后方面也表现出应用价值。
【
【发明内容】
】
[0004]本发明的目的在于提供一种抗NSE单克隆抗体以及建立一种简单且具高灵敏度的检测NSE含量的方法，该方法可应用于癌症的检测。以解决现有的单克隆抗体检测NSE的灵敏度不够或价格昂贵，不适合临床大规模的应用的缺点。
[0005]本发明获得了能够产生特异性识别NSE的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株9_1与杂交瘤细胞株2-2，此2株细胞株分别在2015年7月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C2015103与CCTCCNO:C2015104o此外，经过鉴定，两株单克隆抗体分别识别NSE的两个不同表位，通过9_1与2-2的结合建立了双抗体夹心酶联免疫反应方法，其是一种高灵敏度及高通量的检测系统。
[0006]因此，本发明提供了下面所述的I至3的内容:
[0007]1.抗NSE的杂交瘤细胞株，其保藏号分别为CCTCC NO:C2015103和CCTCC NO:C2015104。
[0008]2.抗NSE的单克隆抗体，分别由保藏号为CCTCC NO:C2015103和CCTCC NO:C2015104的杂交瘤细胞系所分泌，所述单克隆抗体命名为9-1和2_2。
[0009]3.如权利要求2所述的抗NSE单克隆抗体的应用，即利用所述的单克隆抗体的双抗体夹心法ELISA检测NSE，夹心法两两配对的抗体来源于保藏号为CCTCC NO:C2015103杂交瘤分泌的抗体9-1和保藏号为CCTCC NO:C2015104杂交瘤分泌的抗体2_2，其步骤包括:
[0010](I)以所述的两两配对的单克隆抗体9-1包被；
[0011](2)加入待测样品孵育；
[0012](3)以所述的两两配对的HRP标记的另一株单克隆抗体2-2作为二抗，加入反应体系;
[0013](4)洗涤后加入酶反应底物，以450nm读取OD值；
[0014](5)结果表明检测的灵敏度很高。
【【附图说明】】
[0015]附图1显示的是本发明中的杂交瘤所产生的抗NSE单克隆抗体在ELISA方法中滴度测量结果。
[0016]附图2显示的是标记HRP的抗NSE单克隆抗体滴度测量结果。
[0017]附图3显示的是夹心法ELISA(S-ELISA)系统的检测灵敏度。
【【具体实施方式】】
[0018]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阐述了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样是本申请中权利要求书中所限定的范围。
[0019]实施例1:动物免疫
[0020]选择与所用的骨髓瘤细胞同源的8周龄左右的雄性Balb/C健康小鼠，抗原是蛋白量为30ug的NSE与弗氏完全佐剂、PBS混合，完全乳化后，30ug每只每次，采取背部多点，及腋下、腹股沟免疫。免疫程序:经15天后进行第二次相同剂量与弗氏不完全佐剂混合免疫；再15天后进行第三次相同剂量与福氏完全佐剂混合免疫；10天后尾部取血用间接ELISA方法测血清滴度，用相同剂量的纯抗原不加佐剂加强免疫；3天后取脾细胞进行融合。
[0021]实施例2:杂交瘤细胞的构建
[0022]1、骨髓瘤细胞株的培养及制备
[0023](I)本发明采用的是SP2/0骨髓瘤细胞株，该细胞株生长及融合效率均佳，倍增时间为10-12小时。融合时选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞。骨髓瘤细胞在融合前应先在培养基上作适应培养，使细胞生长到最佳的状态(即对数生长期)；
[0024](2)将培养的SP2/0吸至50mL的管中，离心，弃上清，悬起，加1mL的培养基，吸取少量10倍稀释计数。
[0025]2、脾细胞的制备
[0026](I)将小鼠放在密封袋中，充CO2待其窒息死亡；
[0027](2)将小鼠消毒固定在解剖板上，在超净工作台中取脾，放在12mL培养基的培养皿中，剥掉粘连组织，研磨脾脏，直至剩白色组织为止，吸管全部吸起，再缓慢打出使组织块粘连的管壁上，离心，弃上清，加1mL的红细胞裂解液裂解lOmin，再加20_25mL的培养基终止其反应，离心后，弃上清，加1mL的培养基，吸取少量10倍稀释计数。
[0028]3、细胞融合
[0029]加强免疫后3天做细胞融合。
[0030]细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是取处于对数生长期的Sp2/0细胞与脾细胞1: 10混和，通过聚乙二醇(PEG)法以获得杂交瘤细胞，命名为9-1和2-2。所获得的杂交瘤细胞悬浮在含有饲养细胞的HAT培养基中，然后加入到96孔板中，在37°C，5%CO2的培养箱中封闭培养12天。
[0031]实施例3:单克隆抗体的制备及筛选
[0032]1、单克隆抗体的制备
[0033]从实施例2中所获得的杂交瘤细胞的孔格中回收培养基的上清液，选取在ELISA方法中与NSE抗原反应的单克隆抗体。
[0034]2、单克隆抗体的筛选
[0035](I)将10uL浓度为0.5ug/mL的NSE抗原到96孔板的每个孔格中，于4°C过夜后使其固定于固相；
[0036](2)用150uL浓度为I %的牛血清白蛋白进行封闭2小时；
[0037](3)将10uL杂交瘤细胞的培养基上清液加入到每个孔格中，于37°C反应2小时，然后加入稀释10000倍的辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠抗体于37°C反应I小时；
[0038](4)使用四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物(TMB)作为底物进行显色20min ;
[0039](5)添加50uL浓度为0.lmol/L的硫酸终止反应后，测量450nm的吸光度；
[0040](6)选出吸光度大约为3的9-1和2-2，并通过有限稀释法进行亚克隆。
[0041]3、单克隆抗体的大量制备及和纯化
[0042]将亚克隆后的细胞用细胞培养转瓶进行扩大培养，约20天后，收集上清，用葡萄球菌A蛋白(Protein A)进行亲和层析纯化。得到的单克隆抗体分别命名为9_1与2_2。
[0043]4、单克隆抗体效价的测定
[0044]所筛选出的2种mAb的效价通过ELISA方法来测定。分别加入9_1、2_2 (1ug/mL)，在反应后，使用辣根过氧化物酶偶联的抗-小鼠抗体与TMB进行显色，两种mAb效价达到10 9以上(附图1所示)。
[0045]实施例4:单克隆抗体的标记及滴度的测定
[0046]将纯化出得各抗体按常规方法进行HRP标记，标记好的单克隆抗体的滴度通过下面的方法测定，将浓度为0.5ug/mL的NSE抗原固定在96孔微板上(10uL/孔)。使用I %的牛血清白蛋白进行封闭2小时，加标记的单克隆抗体(第一孔稀释100倍)，从第二孔开始做4倍稀释，于室温下反应2小时。添加TMB后，反应在室温下进行20分钟，用0.1mol/L的硫酸中止反应。测量在450nm的吸光度，按实施例3中的方式获得针对固定在固相中的抗原的滴度。结果表明具有有效的滴度(附图2所示)。
[0047]实施例5:双抗体夹心ELISA检测NSE方法的建立
[0048](I)以所述的两两配对的单克隆抗体之一包被，0.5ug/mL的单克隆抗体以10uL/孔的量加到微孔板土，于4°C孵育24小时固定于固相；
[0049](2)孔格使用含有 0.1 % Tween 20 的 pH 值为 7.4 的 20mM PBS (PBST)，以 200uL/孔的量洗涤2次。以150uL/孔的量加入I %牛血清白蛋白进行封闭2小时；
[0050](3)孔格用PBST以200uL/孔的量洗涤4次，加入由起始浓度lug/mL连续4倍稀释NSE抗原，于室温温育2小时，然后加入HRP标记的另一株抗体(I: 5000 ；10uL/孔)并于室温温育2小时；
[0051](4)添加TMB后，反应在室温下进行20分钟，加入0.lmol/L的硫酸来终止反应并测量450nm的吸光度；
[0052](5)结果表明检测的灵敏度很高(附图3所示)。
【主权项】
1.抗NSE的杂交瘤细胞株，其保藏号分别为CCTCCNO:C2015103和CCTCC NO:C2015104。2.抗NSE的单克隆抗体，分别由保藏号为CCTCCNO:C2015103和CCTCC NO:C2015104的杂交瘤细胞系所分泌，所述单克隆抗体命名为9-1和2-2。3.如权利要求2所述的抗NSE单克隆抗体的应用，即利用所述的单克隆抗体的双抗体夹心法ELISA检测NSE，夹心法两两配对的抗体来源于保藏号为CCTCC NO:C2015103杂交瘤分泌的抗体9-1和保藏号为CCTCC NO:C2015104杂交瘤分泌的抗体2_2，其步骤包括: (1)以所述的两两配对的单克隆抗体9-1包被； (2)加入待测样品孵育； (3)以所述的两两配对的HRP标记的另一株单克隆抗体2-2作为二抗，加入反应体系； (4)洗涤后加入酶反应底物，以450nm读取OD值； (5)结果表明检测的灵敏度很高。
【专利摘要】抗NSE单克隆抗体产生的杂交瘤的制备，属于免疫分析医学领域。本发明提供了一种特异性识别NSE的单克隆抗体，产生该单克隆抗体的杂交瘤，以及使用该单克隆抗体检测NSE的高灵敏度的方法。CCTCC NO：C201510320150717
【IPC分类】G01N33/577, C07K16/40, C12N5/20, C12R1/91, G01N33/573
【公开号】CN105132380
【申请号】CN201510454238
【发明人】窦巍巍, 刘云成, 李春雷, 张 杰, 卢亚波, 崔嵩
【申请人】大庆麦伯康生物技术有限公司
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年7月25日