microRNA抑制剂、microRNA抑制剂表达载体及其构建方法和应用

文档序号:9411522阅读:2953来源:国知局
microRNA抑制剂、microRNA抑制剂表达载体及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域,主要涉及一种microRNA抑制剂、microRNA抑制剂表达 载体及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] micorRNA(miRNA)是一类天然存在的长约17~25个碱基的非编码小RNA,广泛存 在于动物、植物、线虫等真核生物中,在生物间具有高度同源性。编码miRNA的基因在核内 经RNA聚合酶转录为初级miRNA(pri-miRNA),经过Drosha、Dicer等酶作用下进一步加过 成成熟miRNA(maturemiRNA)。成熟miRNA与Ago等相关蛋白形成RISC复合体调控相关蛋 白表达。复合体以成熟miRNA为导向,通过与靶mRNA3'非翻译区(3'-UTR)的特异性结 合,降解靶mRNA或阻遏其转录后翻译,最终导致靶基因的蛋白质合成减少。miRNA广泛参 与从细胞到整体的生命过程、估计超过三分之一的人类基因受其调控,目前已经记录超过2 万条miRNA,其中在人类中发现的miRNA为2042条。大量实验表明,miRNA的异常表达会导 致基因调控改变、最终表现为恶性肿瘤等重大疾病。对于miRNA的功能研究及应用离不开 miRNA的抑制,而目前缺乏经济有效的抑制miRNA的方法,传统的化学合成拮抗物普遍存在 毒性过高、不稳定、造价高、作用时间短等缺点。因此,对于miRNA深入研究及应用,需要一 种能够快速、有效、经济地抑制miRNA方法。
[0003] 目前关于miRNA的研究内容涉及范围十分广泛,研究包括发育过程,生理反应以 及许多病理学特征。然而,特定miRNA在不同环境中的功能研究还在起步阶段。通过生物信 息学预测,一个miRNA往往能靶向上百个靶基因,而仅仅只有一部分得到了实验验证。在研 究过程中,往往通过过表达或者抑制来验证miRNA-靶基因的相互作用。过表达即导入外源 miRNA前体或类似物可引起系统内特定miRNA大量表达,导致系统内靶mRNA水平的下降,但 高剂量的外源miRNA前体或类似物同样容易使其他研究外的基因表达变化。相对与miRNA 的过表达研究,miRNA的功能丧失(loss-of-function)是更为行之有效的研究方法。目前 miRNA缺失实验的方法主要有三种:基因敲除,反义寡聚核苷酸和海绵体技术。
[0004] 基因敲除就是将编码miRNA的基因敲除,再观察特定miRNA完全缺失后对表型的 影响。基因敲除技术主要应用于动物模型的建立,而最成熟的实验动物是小鼠,对于大型哺 乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。目前用于基因敲除和基因嵌入的技术有Cre/Lox P系统、FLPI系统等。Zhao(Cell,ZhaoandRansometal.,2007)的研究发现miR-1 可以 通过作用于Hand-2基因适时关闭其介导的蛋白制造,以促使心脏正常发育。miR-1基因敲 除可敲除可导致一系列心脏形态异常。单独敲除小鼠miR-1-2,保留miR-1-l,可导致50% 的小鼠因发生大的室间间隔缺损而死亡。由于基因敲除需要非常好的实验条件才能进行, 而且成功制作一只特定miRNA基因敲除的模型动物周期很长、耗费的人力物力是大多数研 究者无法承担的,同时,许多miRNA基因有着相同的种子序列,因此miRNA家族中的一个成 员可补偿另一个的损失。若想创建一个将miRNA家族中所有成员都删除的动物模型,难度 相当之大。
[0005] 反义寡聚核苷酸是经化学修饰的寡聚核苷酸,常用的修饰方法包括2'甲氧化、脱 氧化和脂质化。反义寡聚核苷酸根据目的miRNA的反义序列合成,并经过一定的化学修饰, 增加其化学稳定性,利用转染试剂就可以将其导入研究的细胞或组织内。目前市场上最常 见的反义寡聚核苷酸抑制剂是antagomir,它是由一系列甲基化碱基由硫代连接,并由胆固 醇修饰而成。Roberts等(Nucleicacidsresearch,RobertsandLewisetal.,2011)将 miR-122的反义寡聚核苷酸抑制剂注入受慢性感染C型乙肝病毒的大猩猩体内,发现其病 毒承载量有明显下降。Sage等(TheEMBOjournal,leSageandNageletal.,2007)利用 antagomir抑制miR-221和miR-222来调节革E基因p27kipl,结果促进了肿瘤细胞的增殖。 Tavazoie等(Currentmedicinalchemistry,MoriandShrestha, 1997)利用antagomir 抑制miR-126,促使肿瘤细胞的增殖和分化。经化学修饰的寡聚核苷酸实现了短期分析,在 细胞培养物以及某些动物实验中都获得了成功。不过,对于活体研究,miRNA抑制剂需要重 复注射,使用费用昂贵,另外这个抑制剂由于化学修饰常常引起机体免疫反应,具有较高毒 性。
[0006]miRNA海绵体是一种基于碱基互补原理构建的含有多个miRNA结合位点的核苷酸 序列,旨在竞争性抑制miRNA功能。当海绵体在系统内大量表达的时候,它能够特异性地 结合一系列拥有同一种子序列的miRNA家族。根据miRNA海绵体的思路,已经衍生出许多 不同类型的结构,如targetmimics(Naturegenetics,ChitwoodandTimmermans, 2007), decoys(Cellcycle,YangandRutnametal.,2012),miRNAerasers(RNAEbertand Sharp, 2010)。在这些结构中的miRNA的结合位点可以是完全或不完全互补序列,后者是指 在miRNA互补序列中间人为插入不匹配序列,可以降低Ag〇2介导的内源性核苷酸的切割。 目前miRNA海绵体常应用于研究特定miRNA在不同通路上的分析。Barbato等(Journalof neurochemistry,BarbatoandRubertietal.,2010)人用海绵体在小脑颗粒元有丝分裂 细胞中抑制miR-92的表达,miR-92在神经元分化过程中表达下调。在体外实验的第六天, 导入miRNA海绵体的神经元细胞出现钾氯协同转运蛋白KCC2和响应GABA处理的电化学 变化。同样,huang等(FEBSletters,GaoandWangetal.,2014)下用逆转录病毒包装 miR-204海绵体并转染间充质干细胞,持续抑制能强烈地减少脂肪方向的分化同时增加成 骨方向标志物表达量的增加。miR-144和miR-451在网织红细胞中特异地成簇存在,为了验 证它们在血细胞发育的作用,用不同荧光报告系统针对每个研究的miRNA构建海绵体,并 用慢病毒包装转染。三到四周后用流式细胞仪分析发现两个miRNA在红细胞生成的整个过 程中缺一不可,并且它们时相互独立地作用。目前市场上最有应用价值的海绵体是海绵体 decoys,但存在的问题是制作一个海绵体decoys需要合成一长片段(100~200bp)的DNA 序列,再将其整合到载体中使用,操作过程较为复杂、造价较高,且一个海绵体decoys分子 仅有2个miRNA结合位点。
[0007] 因此,现有技术还有待于改进和发展。

【发明内容】

[0008] 鉴于上述现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种microRNA抑制剂、 microRNA抑制剂表达载体及其构建方法和应用,所述microRNA抑制剂为miRNA粘附分子 (doublemiRNAadhesionnucleotide,dMAN),是基于miRNA海绵体原理进行设计的一类竞 争性吸附的miRNA抑制剂,可用于高效吸附靶miRNA,旨在解决现有抑制miRNA的方法存在 的效率低、副作用大或成本高等问题。
[0009] 本发明的技术方案如下:
[0010] 一种microRNA抑制剂,其中,所述一种microRNA抑制剂为双拷贝miRNA粘附分 子,由通用直链互补序列、通用茎环序列及2个miRNA结合区序列3部分组成。
[0011] 所述的microRNA抑制剂,其中,所述通用直链互补序列为18个碱基对;所述 miRNA结合区序列与成熟miRNA序列互补,并在与miRNA5'端第10、第11位互补的碱基之 间引入4个不配对的碱基;所述通用茎环序列其茎为8个碱基对,环为4个碱基。
[0012] -种用于表达如手上所述的microRNA抑制剂的miRNA抑制剂表达载体,其中,包 括:
[0013] 背靠背连接的H1-U6双启动子序列,其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示;
[0014] 通用受体载体pLVX-dMAN,其核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示;
[0015] 双拷贝miRNA粘附分子的DNA序列。
[0016] -种如上所述的miRNA抑制剂表达载体的构建方法,其中,包括以下步骤:
[0017] S1、以基因组为模板,H1-F:5' -TGTGGTCTCATACAGAACTT-3' 和 H1-R:5'-CCGACCTTGGGAACGCTGACGTCAT-3' 为引物序列,扩增H1 启动子序 列;以基因组为模板,以U6-F:5'-GTCAGCGITCCCAAGGTCGGGCAGG-3' 和U6-R: 5'-GGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3'为引物序列,扩增U6启动子序列;将两个启动子序列配置在 同一体系中,再利用H1-F和U6-R引物通过OverlapPCR,将两个启动子以背靠背方式进行 串联,构建成背靠背连接的H1-U6双启动子序列;
[0018]S2、以dMAN-UN-F:5'-CGATAAAAAAGACGGCGCTAGGAGAGTCTTCTGAGACGCGTCTCTGCCAA CTTGAGCTGAGTCGTCTTTTTTG-3 ' 和dMAN-UN-R: 5 '-AATTCAAAAAAGACGACTCAGCTCAAGTTGGCAGAG ACGCGTCTCAGAAGACTCTCCTAGCGCCGTCTTITIT-3'为用于构建通用受体载体的引物,通过引物 退火的方式形成双链片段,通过Clal和Xhol位点,插入到商业化载体pLVX-puro中,构建 成通用受体载体;
[0019] S3、以S1的H1-U6双启动子序列为模板,以4条用于构建dMAN的引物,经过两轮 PCR扩增获得完整dMAN序列,并通过限制性内切酶酶切及
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