一种调控杨树不定根发育的生长素受体基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种调控不定根发育的生长素基因及其应用，尤其涉及一种调控杨树 不定根发育的生长素受体基因PtrFBLl及其应用，属于植物基因工程和生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 随着近年来分子生物学技术的发展和杨树基因组测序工作的完成，杨树已经成为 一种研究多年生植物的木材形成、生长发育、季节变化规律、性别决定、开花以及生物互作 的模式植物。杨树本身是一种在世界范围广泛分布的经济树种，不仅是重要的木材原材料， 也被认为是一种重要的能源植物，具有分布广、适应性强、早期速生、易杂交改良和繁殖等 特点，因而广泛用于速生材栽培。杨树栽培多通过硬枝扦插来进行无性繁殖，而目前许多优 良杨树无性系尤其是白杨派树种扦插生根非常困难。因此，加强木本植物扦插生根机理研 究，利用分子生物学和基因工程技术提高杨树扦插生根能力具有重要理论意义和实际应用 价值。
[0003] 不定根是指植物地上部分的茎、叶或下胚轴上所形成的根，其生长发育受外在环 境和内源激素的协同作用。植物通过不定根的形成方式使其具备了形成更多根系的能力， 让植物或细胞具有了再生能力，它的这种作用形式在植物组织扦插和组织培养等无性繁殖 中发挥着越来越巨大的作用。在激素调控中，生长素是最关键的内源激素，其他激素主要通 过与生长素互作来调节不定根的发育，生长素不仅可以直接作用于胞内组分而影响细胞反 应，还可以间接方式调控生长发育相关基因的表达。因此，研究木本植物不定根发育的分 子形成机理，必然要涉及到生长素信号转导的相关基因具体的表达研究，这个过程核心内 容是生长素信号的识别以及下游相关基因的表达。分离生长素调控不定根发育相关的关键 基因，鉴定其生物学功能，通过遗传改良促进难生根植物生根，是林木分子育种重要研究内 容，不仅对林木根系发育生物学研究有重要理论意义，而且在林木良种无性系繁殖生产中 具有潜在的应用价值。生长素与生长素受体（TRANSPORTINHIBITORRESPONSE1，TIR1)结 合后，通过泛素化途径降解Aux/IAA转录抑制因子，激活生长素响应因子（Auxinresponse factor，ARF)蛋白，进而调控生长素响应基因的表达。TIR1是唯一在细胞核中调节下游生 长素响应基因转录的生长素受体，因此，TIR1是生长素信号转导系统的关键基因，其先形成 SCFTIR1-Aux/IAA复合体，再与Aux/IAA启动子区域的顺式作用元件AuxRE结合，启动Aux/ IAA蛋白泛素介导的蛋白水解进程；Aux/IAA蛋白降解，使ARF启动或抑制生长素下游响 应基因的转录，产生生长素效应，完成生长素对基因表达的调节过程。近年来，人们在多种 草本植物中研究发现不同TIR1基因通过调控不同的基因表达影响根系的生长发育，说明 TIR1基因对植物根系发育具有重要的作用。
[0004] 目前在木本植物中，生长素受体调控不定根发育的机制鲜有报道。另外，木本植 物在进化过程中经历了 2次基因组复制事件，部分基因家族发生了扩张或丢失，一些基 因功能也发生了分化，如TIR1基因家族，在拟南芥中有6个成员，在杨树中有8个成员 (PtrFBLls)，其基因家族进行了扩张，部分同源基因的表达模式发生分化。因此，利用木本 植物为研究对象，结合分子生物学和基因工程技术，解析生长素受体调控杨树不定根的分 子发育机制，对于了解木本植物根系发育的分子基础，以及通过分子育种改良难生根林木， 加快林木繁育具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中存在的不足，本发明的主要目的是提供一种调控杨树不定根系的 生长素受体基因PtrFBLl，本发明的另一目的是提供一种调控杨树不定根系的生长素受体 基因PtrFBLl的应用。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
[0007] -种调控杨树不定根发育的生长素受体基因PtrFBLl，其核苷酸序列如序列表中 的序列1所示。
[0008] -种调控杨树不定根发育的生长素受体基因PtrFBLl的表达蛋白，其氨基酸序列 如序列表中序列2所示。
[0009] -种含有调控杨树不定根发育的生长素受体基因PtrFBLl的载体 PMDC32-PtrFBLl，所述载体在PtrFBLl基因的5'端组装组成型强表达启动子P35S;在 PtrFBLl基因的3'端组装有强终止子N0S。
[0010] -种由上述载体组装的HPT基因可作为转基因杨树的筛选标记，用潮霉素进行转 基因杨树的筛选。所述的载体上组装有LB序列和RB序列，LB序列和RB序列能促使组装 于其间的PtrFBLl基因整合至杨树受体细胞染色体中。
[0011] 所述的杨树生长素受体基因PtrFBLl在调控杨树生长发育过程中的应用。
[0012] 本发明的优点：本发明以84k银腺杨为材料，克隆了PtrFBLl基因；同时，构建 过量表达载体PMDC32-PtrFBLl，该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下， PtrFBLl可在杨树体内高效表达，从而调控杨树不定根的发育。其中，PtrFBLl基因是调控 杨树不定根发育的关键基因。
[0013] 与现有技术相比，本发明通过将PtrFBLl基因转入84k银腺杨，过量表达PtrFBLl 的转基因杨树与野生型比较，明显提早生根，且不定根数量明显增多，不定根总长和不定根 总面积显著增大，说明PtrFBLl基因是调控杨树不定根发育的关键调苄基因，在林木基因 工程领域和无性系林业领域有重要应用价值。
【附图说明】
[0014] 图1是植物表达载体PMDC32-PtrFBLl的结构示意图。
[0015] 图2-1至图2-4是过量表达PtrFBLl的未转基因杨树与转基因杨树根系比较图； 图2_1和图2-2为扦插后15天株系根系，图2-3和图2-4为扦插5个月后株系根系。
[0016] 图3是过量表达PtrFBLl的转基因杨树的转录水平定量检测图。
[0017] 图4是过量表达PtrFBLl的转基因杨树与未转基因杨树，不定根发生第15天根系 不定根数目比较图和种植2个月后总根长和总根面积比较图。
[0018] 图5-1和图5-2分别是过量表达PtrFBLl的未转基因杨树与转基因杨树不定根发 生第6天生根图。
[0019] 图6是不定根诱导野生型（84k)与转基因杨树（#B、#D、#F)不同时间的生根率。
[0020] 图7A至图7H为采用生长素处理野生型（84k)与转基因杨树（#B、#D)的根部生长 图及生根率统计图。
[0021] 图8A至图8H是采用BA处理野生型（84k)与转基因杨树（#B、#D)的根部生长图 及生根率统计图。
[0022] 图9A至图9D是采用PEG6000处理的野生型（84k)与转基因杨树（#B、#D)的根部 生长图及生根率统计图。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，以下实施例中未进行详细说明的 操作可参照分子克隆，相关试剂盒使用说明的操作实现。
[0024] 实施例1克隆PtrFBLl基因
[0025]以 84K(P.albaXP.glandulosa)银腺杨为材料，使用RNeasyPlantMini试剂盒 和RNase-freeDNaseI试剂盒（Qiagen，Hilden，Germany)提取扦插 10 天的 84K组培苗 总RNA。每个样品取约 3.0ygRNA通过使用SuperscriptIIIfirst-strandsynthesis system(LifeTechnologies，Carlsbad，CA，USA)合成cDNA第一链。参考已发表的毛果杨 基因组序列，使用Primer5软件设计引物（扩增子包含起始密码子及终止密码子），进行基 因全长扩增（引物中引入GATEWAY接头）。
[0026] 其中，PtrFBLIORF正向引物为（如序列表中序列3):
[0027] GGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGGAATGTTGAGAAAGGCGAATTC,
[0028]PtrFBLIORF反向引物为（如序列表中序列4):
[0029] GGCGGCCGCACAACTTTGTACAAGAAAGTTGGGTATCAAGAAAACCTTGACACAGAATC；
[0030] 高保真PCR反应体系如下：TaKaRa高保真扩增酶PrimeSTAR12y1，正向引物 (10yM) 0? 8y1，反向引物（10yM) 0? 8y1，模板（84K杨cDNA) 0? 8y1，无菌ddH20 补足至 20y1。反应程序：预变性 98°C，5min;98°C，30s;56°C，30s;72°(：，31^11，10个循环；98°(：， 30s;6(TC，30s;72°C，3min，25 个循环；72°C10min。
[0031] 最终获得基因全长cDNA序列为1755bp，命名为PtrFBLl基因，序列如序列表中序 列1所示，其所编译表达蛋白序列如序列表中序列2所示。
[0032] 实施例