肠杆菌耐草甘膦基因deoA、编码蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种肠杆菌耐草甘膦基因deoA、编码蛋 白及其应用。
【背景技术】
[0002] 农田杂草防治是农业生产中重要的作业之一，该类生物每年给全球造成上千亿美 元的经济损失（刘延，2008)，与作物竞争吸收养分、水分、光照、生长空间，使作物产量和 品质受到严重的影响；一些杂草直接寄生在作物上吸收其水分或无机盐等，如无根藤、菟 丝子；杂草可能还更容易携带病虫害使得作物受到感染；有些能够分泌毒性物质对作物有 害。在众多的除草方式中，使用化学除草剂除草是效果最好，应用最广的方式，能有效帮助 提高作物产量，且便于机械化操作等。
[0003] 全球除草剂约230种，其中草甘膦为内吸传导型、非选择性的有机磷类除草剂，对 许多一年生和多年生杂草有极强的控制能力（Lorentz，etal.，2011)，目前全球销量居首 位，大大减少了杂草给农业带来的经济损失。草甘膦是Monsanto公司开发的，于1974年在 美国登记，化学名为N-(磷酸甲基）甘氨酸，商品名为镇草宁，农达（Roundup)等，分子式 为〇10)2?(0)012順01 2(1)011，含有活跃的11离子，在一定条件下可以参与各种反应，分子量为 169.07。
[0004] 由于草甘膦广谱的除草能力，使得该除草剂无法在田间使用，直至Monsanto公司 在1990年获得了抗草甘磷的转基因大豆，草甘膦才得以在田间使用并被推广。抗草甘膦转 基因育种是促使除草剂草甘膦在耕地发挥其作用的基础，在国外相应的转基因作物被广泛 种植，草甘膦的价值得以充分发挥，农业作业得以简化。在抗草甘膦转基因育种过程中，抗 草甘膦基因的获得是一项重要的工作，我国在此方面的研究有一些，但仍未获得较好的抗 性基因，因此该方向的研究仍需进行。
[0005]基因deoA为胸苷磷酸化酶基因，已研究的功能表明其能够将胸腺嘧啶转化成 为胸苷，合成胸腺嘧啶氨基酸，同时该基因可以将胸苷转化为胸腺嘧啶，帮助降解核苷 (Spinazzola, et al.，2002)，该过程在细胞遇到逆境时可帮助降解错误或多余的核苷，具 有一定抗逆能力。
[0006]目前，国内外已克隆多个对草甘膦有一定抗性的突变体基因。新基因的分离和 克隆对转基因抗除草剂植物的培育及防止抗除草剂转基因植物产生交叉抗性，具有重要意 义。本发明就是从草甘膦抗性进化的肠杆菌中分离得到了具有耐草甘膦能力的基因deoA。
【发明内容】
[0007] 1、发明要解决的技术问题
[0008] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供了一种肠杆菌耐草甘膦基因 deoA〇
[0009] 本发明的另一个目的是提供耐草甘膦基因deoA所编码的蛋白。
[0010] 本发明的另一个目的是提供含有上述抗性基因的重组载体。
[0011] 本发明的另一个目的是提供上述基因或重组载体在调控植物对草甘膦抗性及培 育耐草甘膦作物品种中的应用。
[0012] 2、技术方案
[0013] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
[0014] -种肠杆菌耐草甘膦基因deoA，其核苷酸序列如序列表Seq ID NO. 1所示。
[0015] 本发明还提供了一种耐草甘膦基因deoA所编码的蛋白，其氨基酸序列如序列表 SeqIDN0. 2所示。
[0016] 进一步地，本发明提供了一种含有该耐草甘膦基因deoA的重组载体，是将耐草甘 膦基因deoA插入pMDC83植物过表达载体中而成的。
[0017] 进一步地，本发明提供了扩增所述耐草甘膦基因deoA全长或其任意片段的引物 对，该引物对的上游引物如序列表SeqIDNo.3所示，下游引物如序列表SeqIDNo.4所示。
[0018] 进一步地，本发明提供了所述耐草甘膦基因deoA或所述重组载体在调控植物对 草甘膦抗性中的应用。
[0019] 进一步地，本发明提供了所述耐草甘膦基因deoA或所述重组载体在培育耐草甘 膦作物品种中的应用。
[0020] 进一步地，本发明提供了一种培育转基因植物的方法，就是将所述耐草甘膦基因 deoA通过重组载体导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物抗草甘膦性高于所述 目的植物。
[0021]3、有益效果
[0022] ⑴本发明所提供基因deoA的功能是参与肠杆菌耐草甘膦胁迫应答反应，过量表 达deoA的拟南芥与未转基因的拟南芥相比，耐草甘膦的能力得到显著提高，表明该基因对 提高植物的耐草甘膦方面起着一定的作用。
[0023] ⑵本发明的deoA可作为目的基因导入植物，提高植物耐除草剂的能力，以进行植 物品种改良，所编码的蛋白质具有耐逆功能。
[0024] ⑶利用任何一种可以导入外源基因并在植物中表达的载体，可将本发明deoA基 因导入植物细胞，可获得耐草甘膦能力得以提高的转基因植物。
[0025] ⑷使用本发明的基因deoA构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上 任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及 筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因（GUS基 因、荧光素酶基因等）或具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）。 从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以除草剂逆境筛选转化植 株。
[0026] (5)携带有本发明deoA的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载 体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并 将转化的植物组织培养成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物如水稻、小麦、玉米 等，也可以是双子叶植物如大豆、黄瓜、苜蓿、番茄等。
【附图说明】
[0027] 图1为本发明肠杆菌耐草甘膦基因deoA克隆的PCR检测电泳图。
[0028] 图2为基因deoA在工程菌大肠杆菌BL21中的蛋白质表达情况分析（SDS-PAGE 图）；注：marker从上至下分别是 116. 0KD、66. 2KD、45. 0KD、35. 0KD、25. 0KD、18. 4KD、 14. 4KD，图从左往右分别是marker、诱导前对照、诱导后菌的总蛋白、总蛋白经超声波裂解 后的沉淀、总蛋白经超声波裂解后的上清。
[0029] 图3为工程菌大肠杆菌BL21对草甘膦的耐性分析图。
[0030] 图4为转基因拟南芥T3代阳性苗（潮霉素抗性）的效果图。
[0031] 图5为转基因拟南芥T3代阳性苗deoA基因插入情况的PCR检测电泳图。
[0032] 图6为转基因拟南芥耐草甘膦性状分析对比图；注：对生长了约14天的植株进行 草甘膦（终浓度〇. 5mM)的48h的处理，观察其表型。
[0033] 图7为草甘膦处理下deoA在拟南芥中的表达分析图；注：对生长了约14天的植株 进行草甘膦（终浓度0. 5mM)的24h的处理，每隔6h取一次样。
[0034] 图8为基因deoA与革E1基因aroA关系的信息学分析图。
[0035] 图9为细菌双杂中基因的westernblot验证的PCR检测电泳图；注：基因deoA编 码的蛋白大小为47KD，Marker从上至下分别是100、70、50、40、30、25KD。从图中可以看到 基因得到了良好的表达。
[0036] 图10为细菌双杂图；注：图中1为阳性对照；2、3为阴性对照；4为双杂实验。
【具体实施方式】
[0037] 下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。
[0038] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0039] 实施例1 :肠杆菌耐草甘膦基因deoA的克隆
[0040] (1)设计引物，提取微生物肠杆菌DNA:
[0041] 用细菌总DNA提取试剂盒（购自天根公司）提取微生物肠杆菌 (Enterobacteriaceae)的DNA，根据NCBI数据库中已有的大肠杆菌deoA基因序列设计引 物进行同源克隆。扩增的引物序列为：
[0042] SeqIDN0. 3 :上游引物 5' -CACATTTCCCCCGATTCC-3' ；
[0043] SeqIDN0. 4 :下游引物 5' -ATGTGGCCCATGGTATCAG-3'。
[0044] (2)PCR扩增，具体步骤如下：
[0045] 步骤一：以肠杆菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得特异性片段，按照以下 组分顺序配制PCR反应液（50uL体系，东洋纺，KO