除草剂降解酶基因、工程菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种阿特拉津除草剂降解酶基因、含有 上述降解酶基因的工程菌以及上述工程菌的应用。
【背景技术】
[0002] 阿特拉津又名莠去津，其是一种三嗪类除草剂。阿特拉津除草剂的大量使用，导致 对土壤、地下水和地表水的污染。阿特拉津对动物的生殖功能影响已被证明，且被世界野 生动物基金会列为环境荷尔蒙（内分泌干扰剂）的可疑物质，有扰乱内分泌的作用，是人 类潜在的致癌物。为了治理和修复阿特拉津污染的环境，很多研究人员分离和鉴定了大量 能降解阿特拉津的细菌，可将这些菌主要分为两类。第一类是假单胞菌属Pseudomonas，例 如：代表菌株为Pseudomonas sp. ADP，其含有atzA、atzB、atzC、atzD、atzE、atzF六个降解 基因；第二类是节杆菌属Arthrobacter，例如：代表菌株为Arthrobacter sp. TC1，其含有 trzN和atzB、atzC三个降解基因。上述两类细菌的降解途径中第一步反应都是将有毒的 阿特拉津降解为无毒的羟基阿特拉津。现有技术研究发现由trzN基因编码的三嗪水解酶 比atzA基因编码的阿特拉津氯水解酶具有更广泛的应用性且催化能力更高。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于针对阿特拉津除草剂的降解问题，提供一种阿特拉津除草剂降 解酶基因。
[0004] 本发明的目的可通过以下的技术措施来实现：
[0005] -种除草剂降解酶基因，其为阿特拉津降解酶的编码基因，所述除草剂降解酶基 因具有如SEQ ID No :1所示的核苷酸序列。
[0006] 本发明还提供了一种重组质粒，其为含有上述的除草剂降解酶基因的pET_28b(+) 重组质粒。
[0007] 本发明另外提供了含有上述的除草剂降解酶基因的基因工程菌E.coli BL21(DE3)〇
[0008] 上述基因工程菌的构建方法包括如下步骤：
[0009] 细菌总DNA提取步骤：将保藏号为CGMCC N0. 4165的盐单胞菌SY-AD-9于LB培养 基中进行培养，收集菌体提取总基因组DNA ;
[0010] 目的基因的PCR扩增步骤：以SEQ ID No :2所示的核苷酸序列为上游引物，以SEQ ID No :3所示的核苷酸序列为下游引物，以所得总基因组DNA为模板进行PCR扩增获得如 SEQ ID No :1所示的除草剂降解酶基因片段；
[0011] 构建重组质粒的步骤：将所得除草剂降解酶基因片段与pET-28b(+)质粒依次进 行双酶切和连接反应获得含有除草剂降解酶基因的pET-28b(+)重组质粒；
[0012] 重组菌构建步骤：将所述的含有除草剂降解酶基因的pET-28b(+)重组质粒转化 到宿主菌E. coli BL21 (DE3)获得含有除草剂降解酶基因的基因工程菌E. coli BL21 (DE3)。
[0013] 优选地，在目的基因的PCR扩增步骤中的PCR反应参数为：95°C预变性10分钟； 94°C变性1分钟，66 °C退火30秒，72 °C延伸30秒，进行30个循环；72 °C再延伸5分钟。
[0014] 优选地，所述目的基因的PCR扩增步骤之后还包括除草剂降解酶基因片段纯化的 步骤。
[0015] 优选地，所述重组菌构建步骤之后还包括基因工程菌E.coliBL21 (DE3)阳性克隆 筛选的步骤。
[0016] 本发明还提供了上述的除草剂降解酶基因以及上述的含有除草剂降解酶基因的 基因工程菌E.coliBL21(DE3)在降解阿特拉津除草剂中的应用。
[0017]与现有技术相比，本发明的有益效果如下，本发明的除草剂降解酶基因来源于一 株高效降解阿特拉津的盐单胞菌Halomonassp.SY-AD-9,其表达产物三嗪水解酶能够高效 的降解阿特拉津；本发明利用上述除草剂降解酶基因构建的工程菌能够高效的表达除草剂 降解酶（三嗪水解酶），能够应用于环境的生物修复。
【附图说明】
[0018] 图1是本发明的工程菌的构建方法流程图。
【具体实施方式】
[0019] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施 例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于限定本发明。
[0020] 除非另有定义，本发明使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相 同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员可参考Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的 标准3字母和/或1字母代码。
[0021] 尽管本发明的广义范围所示的数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自 测量中存在的标准偏差所致。另外，本发明公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何 和所有子范围。例如记载的"1至10"的范围应理解为包含最小值1和最大值10之间（包 含端点）的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至 6. 1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5. 5至10。另外，任何称为"并入本文"的 参考文献应理解为以其整体并入。
[0022] 另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非 清楚且明确的限于一个所指对象。术语"或"可与术语"和/或"互换使用，除非上下文另 有清楚指明。
[0023] 术语"部分"和"片段"可互换的指代多肽、核酸或其他分子构建物的一部分。
[0024] 生物材料保藏信息：盐单胞菌Halomonassp.SY-AD-9已于2010年09月13日保存 于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC)，地址为北京市朝阳区北 辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为0611〇：勵.4165，上述菌株163扣嫩 基因序列的GenBank登录号为HM627247,上述菌株具有与trzN基因功能相似的能够将阿特 拉津降解为无毒的羟基阿特拉津的除草剂降解酶基因。
[0025] 为了修复被高浓度阿特拉津污染的土壤，本发明克隆了上述的盐单胞菌 Halomonassp.SY-AD-9菌株的阿特拉津除草剂降解酶基因（类trzN基因）到容易培养且 繁殖速度快的大肠杆菌中，并使目的基因表达，降解污染土壤中的高浓度阿特拉津，以修复 被高浓度阿特拉津污染的土壤。
[0026] 本发明的除草剂降解酶基因具有如SEQIDNo:1所示的核苷酸序列。
[0027] 本发明提供的重组质粒为含有上述除草剂降解酶基因的pET_28b(+)重组质粒。
[0028] 本发明的工程菌为含有上述除草剂降解酶基因的基因工程菌E.coliBL21 (DE3)。
[0029] 如图1所示，上述工程菌的构建方法包括如下步骤：
[0030] 细菌总DNA提取步骤：将保藏号为CGMCCN0. 4165的盐单胞菌SY-AD-9于LB培养 基中进行培养，收集菌体提取总基因组DNA;
[0031] 目的基因的PCR扩增步骤：以SEQIDNo:2所示的核苷酸序列为上游引物，以SEQ IDNo:3所示的核苷酸序列为下游引物，以所得总基因组DNA为模板进行PCR扩增获得如 SEQIDNo:1所示的除草剂降解酶基因片段；
[0032] 构建重组质粒的步骤：将所得除草剂降解酶基因片段与pET_28b(+)质粒依次进 行双酶切和连接反应获得含有除草剂降解酶基因的pET-28b(+)重组质粒；
[0033] 重组菌构建步骤：将所述的含有除草剂降解酶基因的pET_28b(+)重组质粒转化 到宿主菌E.coliBL21 (DE3)获得含有除草剂降解酶基因的基因工程菌E.coliBL21 (DE3)。
[0034] 具体地，本发明的除草剂降解酶基因来源于一株高效降解阿特拉津的盐单胞菌 Halomonassp.SY-AD-9,其表达产物三嗪水解酶能够高效的降解阿特拉津；本发明利用上 述除草剂降解酶基因构建的工程菌能够高效的表达除草剂降解酶（三嗪水解酶），能够广 泛地应用于环境的生物修复。
[0035]实施例1
[0036]trzN基_DNA片段的扩增与纯化
[0037] 第一步，细菌总DNA提取：
[0038] 用天根公司基因组提取试剂盒提取盐单胞菌Halomonas sp. SY-AD-9菌株的基因 组DNA，作为PCR扩增的模板。
[0039] 第二步，trzN基因DNA片段扩增：
[0040]上游引物：5'-GGAATTCCATATGATCCTGATCCGCG-3'（序列表中SEQIDN0. 2)，其中 包含有限制性内切酶Ndel的酶切位点（CATATG);下游引物：5'-CCCAAGCTTCTACAAGTTCTTGG GA-3'（序列表中SEQIDNO. 3)，其中包含有限制性内切酶HindIII的酶切位点（AAGCTT)， 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以盐单胞菌Halomonassp.SY-AD-9菌株的 基因组DNA为模板，采用上述引物进行PCR扩增，扩增的反应条件为：在95°C预变性10分 钟，然后以94°C变性1分钟、66 °C退火30秒、72 °C延伸30秒循环30次，再在72 °C延伸5分 钟。体系体积为25y1，配制如表1 :
[0041]表1
[0042]
[0043]PCR反应完成后，取3y1反应产物用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。
[0044] 第三步，PCR扩增产物的纯化：
[0045] PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后，将目的条带切下，使用TIANGEN公司的琼脂 糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化PCR片段，其操作步骤如下：
[0046] 柱平衡：向吸附柱CA2中加入500y1平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集 管中的废液，将吸附柱CA2重新放回收集管中；
[0047] 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量；
[0048] 向胶块中加入3倍体积溶胶液PN，当回收片段小于150bp或者琼脂糖浓度大于 2%时，需要使用6倍体积溶胶液PN，50°C水浴放置10分钟，其间不断温和的上下翻转离心 管，以确保胶块充分溶解。如还有未溶的胶块，可补加一些溶胶液或者继续放置几分钟，直 至胶块完全溶解；
[0049] 将上一步所得的溶液加入一个吸附柱CA2中，室温放置2分钟，12000rpm离心 30~60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中；
[0050]向吸附柱CA2中加入600 y 1漂洗液PW(使用前检查是否加入无水乙醇）， 12000rpm离心30~60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入