一种启动子筛选系统的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程和遗传工程领域，主要涉及将质粒PSSR-LacS上的半乳糖苷酶编码序列入到切除了阿拉伯糖启动子(ara promoter)的质粒pSeSD中，构建出硫化叶菌启动子筛选质粒pSeSD-LacS。如果将硫化叶菌及其病毒的具有潜在启动子功能的序列插入到pSeSD-LacS中并转化到硫化叶菌E233S中启动因的表达，则表明该序列是一个启动子。
【背景技术】
[0002]古菌是一类单细胞的微生物，由于形态上与细菌相似，在很长一段时间里(Achaed)被划归为细菌(Bacteria)。20世纪70年代末，Woese根据SSU rRNA系统发育树揭示了古菌在进化树上与细菌距离很大，并将被其命名为古细菌，即Archaebacteriai^oese& Fox, 1977)，随后将其简称为古菌(Archaea)，并将古菌与细菌、真核生物列为平等的3个域。古菌的细胞膜含由分支碳氢链与D型磷酸甘油，以醚键相连的脂类；而细菌和真核生物的细胞膜则含有不分枝脂肪酸和L型磷酸甘油，以醋键相连接而成脂类。细菌细胞壁的主要成分是肤聚糖，而古细菌细胞壁不含肤聚糖(Kandler & Hippe, 1977) 0在上世纪90年代，随着高通量测序技术的应用，大量古菌基因组序列在短时间内测定完成。基因组分析表明古菌具有细菌和真核生物杂合的特性:与细菌相似，古菌染色体成闭合环状，基因也排列成操纵子模式；但在DNA复制。转录和翻译方面，古菌却具有明显的真核特征:启动子、转录因子、DNA聚合酶、RNA聚合酶等均与真核生物的相似(Langer et al., 1995;Brenneis etal., 2007) ο
[0003]泉古菌门(CreflarcAsea)包含3 大分支:除硫球菌目 Zfesi/J/kraeoeeaJes (Huber& Stetter, 2001),热变形菌目 Thermoproteales (Zillig et al., 1981)和硫化叶菌目。硫化叶菌细胞直径从I到5 μπι，所有硫化叶菌种类都是嗜热菌或者超嗜热菌，最适生长温度从65到90°C。这一种类微生物的另一个共同特点是生长最适pH值在2.0-3.0左右。硫化叶菌生长好氧、兼性厌氧或者厌氧。在自养生长条件(autotrophic condit1n)下，硫化叶菌靠氧化硫元素、硫代硫酸盐、硫磺矿或者氢分子获取能量，并以二氧化碳为碳源(有趣的是51 sol fa tari cus^W S.ac1bcWarii/6.不能氧化硫元素)。异养生长条件下，硫化叶菌进行好氧呼吸、厌氧硫呼吸{anaerobicsulfurresPirat1ii)或者有机底物发酵。
[0004]硫化叶菌目(order)包含I 个科(Family)即 Sulfolobaceae (Stetter, 1989)，下含6个属(Genera)，大约20个种(Speeies)。另外，核酸杂交和SSU rRNA分析表明硫化叶菌属iSulfolobus)内各菌之间尽管表型相似，但是遗传联系并不紧密。硫化叶菌属内各菌之间可以按照基因组DNA的GC含量，好氧/厌氧生长或使用不同的电子受体进行区分。与其他古菌相比，硫化叶菌比较容易培养，因此，即使在其遗传操作体系未建立前，古菌学家己经进行了大量的研究。到目前为止，测序完成的硫化叶菌有S.solfataricus(She et al., 2001)，S.tokodaii(Kawarabayasi et al., 2001)，S.acidocaldarius(Chenetal., 2005)和 S.1slandicus{Rer1etal., 2009)。并且建立起完善的遗传操作体系的菌株包括 51 acidocaldarius(wagner et al., 2009; Berkner et al., 2007)和
S.1slandicusi^he et al., 2009; Deng et al.，2009)。
[0005]古菌编码蛋白的基因和编码RNA的基因共用一类启动子结构和RNA聚合酶系统。古菌基本启动子包括2个主要的启动子元件:TALA-box和BRE (转录因子B识别位点，Transcript1n factor B Recognit1n)，以及研究较少的另外两个位点:IE (Initiat1nElement)和近启动子元件 Proximal Promoter Element, PPE; Reeve et al., 1997 ;Soppa，1999 ；图1-3)。TATA-box和BRE主要作为真核生物同源的ΤΑΤΑ-box结合蛋白(TATA_boxbinding protein)和 TFllB (在古菌中成为 TFB)的结合位点(Hausner et al.，1996)。在古菌中，TATA-box作为一个A/T富集的序列位于转录起始位点(Transcript1nstart site, TSS)的上游24-28个碱基左右(Reiter et al.，1990)。大部分古菌的TATA-box代表一个高度保守的8碱基序列(TTTAWAtr，withff=A/T, R=A/G)用于结合TBP0 TBP/TFB/Promoter的晶体结构分析表明TATA-box这8bp与TBP是直接相互作用的(Littlefield et al.，1999)。但是在盐古菌启动子的生物信息学分析表明，TATA-box的前6个碱基才是必需的并足以起始转录(Brenneis et al.，2007)。不同的古菌分支中TATA-box的保守序列有所区别:泉古菌(主要是硫化叶菌)中是“TTTTTAAA”，甲烷古菌{Methanogens)是 “TTTATAT”，而在盐古菌(Malophiles)中是 “NTTTffffffN (W=A or T ；N=anynueleotide) ” (Reeve, 2003)。在古菌基本启动子的基础上，不同启动子一般还具有特异性的调控位点，如阻遏蛋白结合位点和转录激活蛋白结合位点。阻遏蛋白结合位点一般位于TATA-box和BRE附近或者其下游，而激活蛋白结合位点一般位于BRE上游。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种启动子筛选系统，其是将半乳糖苷酶编码序列入到切除了阿拉伯糖启动子的质粒PSeSD中构建得到的，其中半乳糖苷酶编码序列Zac却勺核酸序列如SEQ ID NO:2所示；该筛选系统的质粒模型为pSeSD-LacS，质粒图谱如图1所不O
[0007]上述硫化叶菌启动子筛选系统的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]本发明提供的质粒模型pSeSD-LacS是一种有效的研究古细菌启动子活性的质粒模型，利用硫化叶菌作为古细菌生化和遗传研究的模式生物，该质粒模型有助于作为深入研究DNA转录、复制和修复、微生物多样性、病毒与宿主相互作用等研究领域的新切入点；研究硫化叶菌对于揭示生命活动的基本规律具有重要意义；该基因报告系统和基因表达系统，可用于其它问题的研究；本启动子筛选系统适用于硫化叶菌及其病毒启动子的筛选，通过将潜在的启动子序列插入PSeSD-LacS的Sph I和Nde I酶切位点之间，构建重组载体，将重组载体导入硫化叶菌E233S中进行功能验证，如果转化子表达一种半乳糖苷酶，能在含有X-gal培养基中显蓝色，表明该潜在的启动子序列具有启动子活性。
【附图说明】
[0009]图1为本发明筛选系统的结构图谱示意图；
图2为本发明筛选系统pSeSD-LacS的构建策略示意图；
图3为本发明重组质粒pSeSD-LacS双酶切验证电泳图； 图4为本发明重组质粒模型pSeSD-LacS-P37构建策略示意图；
图5为本发明中重组质粒pSeSD-LacS-P37双酶切验证电泳图；
图6为本发明中X-gal显色反应图。
【具体实施方式】
[0010]下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
[0011]实施例1:半乳糖苷酶基因LacS片段(带有酶切位点序列Nde I/Sal I)的获取取2PL质粒pSSR-LacS为模板进行聚合酶链式反应，设计引物(引物Pl和引物P2)进行PCR扩增，反应所用引物、组分和扩增条件如下:
引物 Pl:LacSF: 5，-GGAATTCCATATGTACTCATTTCCAAATAGCT-3’ (SEQ ID NO:7)
引物 P2:LacSR: 5，-GCGTCGACCTAGTGTTGCAAGGCAGAT-3，(SEQ ID N0:8)
PCR扩增体系(50 PL)组成如下:
模板(pSSR-LacS):2 μ L
2Xphanta max Buffer:25 μ