一种高效表达猪cyp1a1基因的真核表达载体构建方法
【专利说明】
一、技术领域
[0001]本发明涉及一种高效表达猪CYPlAl基因的真核表达载体构建方法，属于分子生物学领域。
二、【背景技术】
[0002]CYPlAl基因属细胞色素P450家族成员，是机体代谢活化多烷芳烃、芳香胺类前致癌物质主要功能酶，最新研究表明细胞色素P450在炎症反应中也发挥重要作用。
[0003]目前，有关CYPlAl基因的报道多集中在人药物代谢和肿瘤发生过程，通过酶活性、mRNA表达和基因水平探讨CYPlAl的药物代谢机理，揭示CYPlAl基因受芳香烃受体调控，激活四氯二苯-P-二恶英(TCDD)等前致癌物质，产生高度亲电子性代谢中间产物，对机体内DNA、蛋白质等生物大分子造成形态畸变、基因突变以及蛋白异常等，进一步引起细胞癌变。而对猪CYPlAl基因的研究报道少见，仅局限在mRNA表达分布上，提出猪CYPlAl基因在肝脏表达最高，其次是胃肠道和肺部组织。
[0004]但猪P450芳香酶的表达调控较其它脊椎动物复杂，有关猪CYPlAl基因的功能并不仅限于代谢酶类。本团队在前期研究中发现，猪CYPlAl基因在疫病感染炎性反应过程中表达显著改变，并与炎性反应关系密切，预示猪CYPlAl基因在炎性反应调控中可能发挥一定作用，而构建猪CYPlAl基因真核表达载体是探讨猪该基因分子功能的前提。因此，本发明阐述的一种高效表达猪CYPlAl基因的真核表达载体构建方法，可实现猪CYPlAl基因在细胞甚至活体水平高效表达，为进一步探讨猪CYPlAl基因在生理代谢、免疫反应等方面的分子机能和调控途径提供了方便与可能。
三、
【发明内容】
[0005]1、技术问题
[0006]本发明的目的在于提供一种高效表达猪CYPlAl基因的真核表达载体构建方法，包含用于高效、特异克隆猪CYPlAl基因的特异引物，特异扩增片段的粘性末端处理，实现高效表达真核载体的选择。构建的高效表达猪CYPlAl基因的真核载体转化进目标细胞或活体，将极大地促进研究者对猪CYPlAl基因结构、功能及分子机理的探究。
[0007]2、技术方案
[0008]本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
[0009]1、一种高效表达猪CYPlAl基因的真核表达载体构建方法，其特征在于以下步骤:
[0010]I)猪CYPlAl基因的克隆
[0011]以猪肝组织样为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，以GenBank中猪CYPlAl基因cDNA序列NCBI Reference Sequence:NM_214412.1为模板设计引物设计包含特异酶切位点和保护碱基的特异引物，应用Primer STARMax高保真酶对猪CYPlAl基因编码序列进行PCR扩增；扩增片段包含猪CYPlAl基因cDNA序列1551bp，酶切位点及保护碱基21bp，片段总长 1572bp。猪 CYPlAl 基因 cDNA 序列见 SEQ ID N0.1。
[0012]2)真核表达载体 pcDNA3.1 (+) /zeo-CYPlAl 的构建
[0013]将CYPlAl基因连接到PMD18-T载体中，转化至DH5a大肠杆菌，提取菌株中pMD-18-T-CYPlAl重组质粒，Xho1、NotI双酶切鉴定后回收CYPlAl基因片段，同时用Xhol、NotI双酶切处理pcDNA3.l/zeo(+)载体质粒，利用T4连接酶与回收的CYPlAl基因片段进行连接后，转化到DH5 a大肠杆菌感受态细胞，提取阳性质粒，测序验证，一种高效表达猪CYPlAl基因的真核表达载体pcDNA3.1/zeo (+)-CYPlAl构建成功。
[0014]设计的特异引物为，
[0015]h游引物 CYP1A1-F:5’ -ATTTGCGGCCGCATGTTCTCTGTGTTTGGAC-3’ (SEQ ID N0.2)
[0016]下游引物CYP1A1-R:5’ -CCGCTCGAGCTAAGAGCGCACATGCA-3’ (SEQ ID N0.3)
[0017]PCR扩增目的片段回收、纯化后，使用Taq酶进行加A尾处理，PCR产物14.5 μ 1，Taq buffer 2.0 μ I, dNTP 3μ1，5υ/μ1 Taq polymerase 0.5 μ 1，72°C孵育 20min，-20°C
保存备用，便于克隆载体构建。
[0018]所述的高效表达猪CYPlAl基因的真核表达载体pcDNA3.1/zeo (+)-CYPlAl可以在制备功能药物中得到应用，特别是指在制备与炎性反应相关的功能药物中应用。
[0019]3、有益效果
[0020]本发明针对猪CYPlAl基因的分子机能研究，提供了一种高效表达猪该基因的真核表达载体的构建方法，用于细胞及活体水平的猪CYPlAl基因代谢调控、免疫反应等生物学功能研究与验证，具很好的实际意义和应用价值，目前未见其它报道。
[0021]本发明通过研究，确定了适合猪CYPlAl基因特异克隆并利于载体构建的特异引物SEQ ID NO: 1-2，优化了载体构建的处理手段与条件，明确了适合猪CYPlAl基因功能研究的质粒载体。
[0022]针对猪CYPlAl基因具药物代谢酶功能，特别选用pcDNA3.1/zeo (+)作为真核质粒载体，利用其高效增强子SV40及高效启动子T7PCMV，促进CYPlAl基因高效表达；并可同时借助pcDNA3.1 (+)/zeo载体的Zeocin抗性，在转染真核细胞时筛选特异抗性克隆。
[0023]炎性调控功能不属于药物代谢酶功能范畴；炎性调控功能是在运用本发明构建的真核表达载体表达的基础上发现的；选用pc DNA 3.1载体是根据该基因具有药物代谢酶特征，为基因表达后能用于后续研究实验特别选用的。应用本发明阐述的方法构建出的高效表达猪CYPlAl基因真核表达载体，转染进猪PAM细胞，建立起过表达猪CYPlAl基因PAM细胞系，用于猪肺炎支原体(Mhp)细胞感染实验，通过对炎性反应调控通路关键受体及炎性因子表达水平的动态监测，发现在肺炎支原体感染PAM细胞的炎性反应过程中，猪CYPlAl基因与炎症反应调控受体PPAR- γ的表达存在明显的正相关，并通过调控PPAR- γ受体表达间接实现对NF-kB、NFAT等炎症活化因子的调控，从而影响机体炎性反应过程，发挥抑炎作用。这一重大发现对猪CYPlAl基因的分子功能研究具有深远的意义，更能有效促进猪支原体肺炎发生的分子基础研究工作。
[0024]而且，应用该高效表达猪CYPlAl基因真核表达载体转染其它相关功能细胞，甚至活体猪特定组织部位，开展细胞代谢、病原感染，以及活体转基因实验，能为进一步揭示猪CYPlAl基因的生物学功能提供可能和技术支撑，有益效果显著。
四、【附图说明】
[0025]图1.猪CYPlAl基因真核表达载体构建过程示意图
[0026]图2.猪CYPlAl基因扩增及克隆载体构建效果示例
[0027]M:DNAMarker (片段大小如图示)
[0028]图A:猪CYPlAl基因PCR扩增结果示例
[0029]图B:重组pMD18-T-CYPlAl菌液PCR鉴定示例
[0030]图C:重组质粒双酶切后电泳示例
[0031]图3.猪CYPlAl基因真核表达载体酶切鉴定效果
[0032]其中:M:DNAMarker(片段大小如图示)；1_2 泳道为 pcDNA3.1 (+)/zeo-CYPlAl 双酶切，3-4泳道为pcDNA3.1 (+) /zeo，5-6泳道为Notl单酶切，7-8泳道为Xhol单酶切，9-10泳道为 pcDNA3.1 (+) /zeo-CYPlAl.
[0033]图4猪CYPlAl基因真核表达载体转染后表达效果鉴定
[0034]图A:真核表达载体转化后重组细胞系RT-PCR检测结果(泳道1:正常细胞扩增片段；泳道2:重组细胞PCR扩增片段)；
[0035]图B:Western-blot表达量灰度值效果图(1_2组:空载转染细胞，3组:正常细胞，4-6组:重组质粒转染细胞).
[0036]图5:不同处理组PAM细胞系感染猪肺炎支原体(Mhp)后PPAR- γ的表达变化
[0037]图Α:猪CYPlAl基因过表达PAM细胞系中PPAR- γ随Mhp感染的表达变化
[0038]图B:转染空载体的猪PAM细胞系中PPAR- γ随Mhp感染的表达变化
[0039]图C:猪CYPlAl基因正常表达(无转染处理)PAM细胞系中PPAR-γ随Mhp感染的表达变化
[0040]*表示与正常对照组差异显著(0.01<Ρ<0.05) ;**表示与正常对照组差异极显著(Ρ〈0.01)
五、【具体实施方式】
[0041]下面结合实施例进一步阐述本发明。本实施例仅用于说明本发明但不用于限制本发明范围。实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件进行，如分子克隆实验手册所述条件或制造厂商建议条件。