一种重组禽干扰素α成品冻干制剂的制备工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制药领域，尤其涉及基因工程干扰素蛋白的冻干制剂生产领域。
【背景技术】
[0002]随着近年来全球畜禽养殖业的迅猛发展，我国养殖业无论是禽类的品种还是数量都位于世界前列。然而，养禽业还存在很多问题，如禽流感、鸭肝炎等病毒传染性疾病，每年都会在不同的季节暴发，这些动物一旦感染发病，具有发病急、临床症状严重、极易传播扩散以及病死率和死亡率均较高的特点，给养殖业造成巨大经济损失；更为重要的是，禽类与人类密切接触，某些病毒性传染病如禽流感等还给人类健康带来潜在威胁。目前禽类传染性疾病的防治主要采用疫苗免疫和药物治疗，由于疫苗免疫的血清型单一，而病毒的血清型复杂，毒株变异快，常导致疫苗免疫失败。一些病毒病目前尚无疫苗可用，有些病毒也可能直接危害到人类的健康。
[0003]目前针对禽传染病常用的药物治疗主要采用人用抗生素和抗病毒化学药物进行治疗，但是引起的食品药物残留问题，给人类健康带来威胁。现在一些国家己明令禁止一些抗生素和抗病毒药物在养殖业中的应用。因此，使用无任何毒副作用的干扰素来治疗和预防禽类病毒性疾病将是当前较为关注的问题。
[0004]干扰素是一类由病毒及脂多糖等物质诱导机体产生的具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的蛋白质，1957年由Issacs和Lindeman首先发现，它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生多种特异性蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖及发挥抗肿瘤等的活性。按照干扰素的产生细胞、生化特征及在机体免疫方面所发挥的作用不同，分为α、β、γ三种型。现已知，干扰素α在体内可有选择性地作用于病毒感染细胞，通过抑制受染细胞内的病毒蛋白质的生物合成，发挥广谱和高效抗病毒作用，但对正常宿主细胞无作用。
[0005]目前重组鸡干扰素α在大肠埃希菌中的表达已有报道，但是其工艺均为以发酵菌体中的包涵体表达目的蛋白，导致生产过程中需要对包涵体表达的蛋白进行变性和复性，从而导致生产工艺复杂化而且成本较高，制约了其在兽医领域的应用。
[0006]冻干保护剂的研究和应用是当前国内兽用生物制品行业中的热点问题，过去冻干保护剂要为蔗糖脱脂牛奶和明胶、蔗糖，制品要求_15°C低温保存，如2?8°C保存仅存6个月，给兽用生物制品贮存和运输带来较大的困难。需要一种新型保护剂能够让生物制品在2?8°C稳定保存24个月以上。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是提供一种重组禽干扰素α成品冻干制剂的制备工艺，以重组禽干扰素α的BL21/pET-32a-rChIFNa工程菌的冻干菌种(安徽九川生物科技有限公司生产，农业部转基因安全证书:农基安证字2014第034号)为原料，其DNA序列如SEQUENCE LISTING 400〈I〉所示，经过以下步骤制得:(I)原液制备；(2)半成品制备；(3)成品制备。
[0008]步骤(I)中具体包括以下步骤:(1-1) 一级生产种子繁殖；(1-2) 二级生产种子繁殖；(1-3)发酵；(1-4)破碎；(1-5)纯化；(1-6)原液检测。
[0009]步骤(1-1)具体包括以下步骤:开启表达重组禽干扰素α的BL21/ρΕΤ-32 a -rChIFNa工程菌的冻干菌种I支，加I?2mL无菌生理盐水溶解成菌悬液，接种于LB固体培养基平板，37°C培养24?36小时，挑取单个菌落，接种于LB固体培养基斜面，37°C培养24?36小时，用5?1mL LB液体培养基洗下菌苔得菌液，加入30%?40%菌液体积的无菌甘油，可避免冻存菌种时水结冰产生冰晶损伤细胞，定量分装成ImL/瓶，得到一级BL21/pET-32 a -rChIFN α工程菌生产种子。
[0010]步骤(1-2)具体包括以下步骤:将一级BL21/pET_32 a -rChIFNa工程菌生产种子接种于LB固体培养基平板，37°C培养24?36小时，用LB液体培养基洗下菌苔得菌液，将菌液接种于LB液体培养基，菌液与LB液体培养基的体积比为1:10?15，37°C摇床震荡培养至OD值为0.8?1.2，制得二级种子菌液。
[0011]步骤(1-3)具体包括以下步骤:将LB液体培养基经103.43Kpa压力在位灭菌，按培养基体积量的10%?20%接种二级种子菌液，37°C发酵，加入酸或碱控制PH值为7.0?
7.2，控制溶氧>30%，待菌液的0D_nni值达到0.6?1.0时加入终浓度为lmmol/L的异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，30?32°C诱导表达，诱导4?6小时，2?8°C温度下离心，湿菌体称重，-20°C冻存。
[0012]步骤(1-4)具体包括以下步骤:用10?15%菌液体积的lOmmol/L磷酸缓冲液(PBS)重悬湿菌体，以800?1500bar压力的高压细胞破碎机破碎，离心，所得上清液重复离心一次，再次收集上清液，得粗制重组禽干扰素α。
[0013]步骤(1-5)所述纯化为亲和层析纯化和离子交换层析纯化，这两种不同原理的纯化方案联用制备出来蛋白纯度更高，纯化后得重组禽干扰素α原液。
[0014]步骤⑵具体包含以下步骤:将重组禽干扰素α原液用2?3倍体积10mmol/L磷酸盐缓冲液稀释，向冻干保护剂混匀，分装成规格为2.2mL/瓶的重组禽干扰素α半成品，此处用PBS作为稀释剂具有盐平衡、可调整的适宜PH缓冲作用，能够保护生物蛋白的结构及生物活性物质保持其最完整的特性。
[0015]进一步地，所述冻干保护剂为终浓度为80?150mL/L脱脂牛奶、0.12?0.25g/mL甘露醇和0.025?0.085g/mL蔗糖，脱脂牛奶在冻干的过程中可以促进升华，易取得均质产品，并扩大细胞相互间的距离。
[0016]步骤(3)具体包含以下步骤:将重组禽干扰素α半成品在-40?_30°C的条件下经冷冻真空干燥工艺，制得重组禽干扰素α成品冻干制剂。
[0017]上述冷冻真空干燥工艺为:将搁架温度降温到-10?-15°c，保持30min?60min，继续降温至_20°C保持30min?60min，之后在_35°C保持1.5h，抽真空进行一次干燥，保持2?3.5h得到白色干燥物，开启隔板加热至30?35°C，维持4h。
[0018]按上述方法制备出的重组禽干扰素α原液目的蛋白的表达量不低于30%，效价大于1.0 X 19单位/mL，纯化后同时采用SDS-PAGE和HPLC对蛋白质纯度进行检测，蛋白纯度均高于95%以上，Lowry法检测蛋白含量大于lmg/mL，比活性达到1.2 X 19单位/mg，分子量为35kD。
[0019]本发明制备的重组禽干扰素α为冻干型，呈白色或淡黄色疏松体，加入注射用水后迅速复溶为澄明液体，干扰素含量彡I X 19单位/瓶，2?8°C可长期保存，在低于25°C室温下可保存两年。
[0020]本发明与现有技术相比，所建立的重组禽干扰素α，是在大肠埃希工程菌菌体破碎后的上清液中表达的目的蛋白，免去了由包涵体形式表达蛋白所需要的变性和复性过程，同时对每一步的制备及生产过程建立了详细的技术参数以及相应的质量控制体系，为重组禽干扰素α产业化生产奠定了基础。
[0021]本发明所制的重组禽干扰素α成品冻干制剂是一类能诱导禽类细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的细胞因子，可采用肌肉注射的方式给药，治疗周期短，疗效迅速，能够用于鸡新城疫病毒和禽流感病毒性疾病的防治。
[0022]本发明的优点是:使用本发明提供的制备方法得到的重组禽干扰素α冻干制剂产品，无论是在纯度、蛋白含量、效价和内毒素等方面均可达到兽用生物制品的要求，且生产工艺适合规模化生产。
【附图说明】
[0023]图1为发酵破碎菌体离心后表达的重组禽干扰素α蛋白SDS-PAGE图；M:蛋白Marker ;1:发酵破碎后上清；2:发酵破碎后包涵体；3:发酵破碎后全菌；
[0024]图2为重组禽干扰素α原液纯化层析色谱图；Α为重组禽干扰素α亲和层析纯化色谱图出为重组禽干扰素α离子交换层析纯化色谱图；
[0025]图3为重组禽干扰素α原液纯化前后SDS-PAGE图；M:蛋白Marker ；4:重组禽干扰素α原液；5:重组禽干扰素α原液亲和层析纯化后样品；6:重组禽干扰素α原液离子交换层析洗脱样(杂蛋白);7:重组禽干扰素α原液离子交换层析纯化后目的蛋白样；
[0026]图4为重组禽干扰素α原液HPLC检测纯度色谱图；
[0027]图5为重组禽干扰素α成品冻干制剂免疫印迹检测结果图；Μ:蛋白Marker ；8:重组禽干扰素α成品冻干制剂。
【具体实施方式】
[0028]下面结合实施案例对本发明作详细的说明，但这并不仅限于本发明的范围。
[0029]重组禽干扰素α的BL21/pET_32 a -rChIFN α工程菌的冻干菌种(农业部转基因安全证书:农基安证字2014第034号)来源于安徽九川生物科技有限公司自制。
[0030]LB液体培养基的配制方法为:胰化蛋白胨100g、酵母提取物50g、氯化钠100g，用8L纯水溶解后，加5M NaOH调节PH值至7.0，再加入纯水至总体积10L。
[0031]实施例1
[0032]一种重组禽干扰素α成品冻干制剂的制备工艺，包括以下步骤:
[0033]1.1原液制造与检测
[0034]1.1.1 一级生产种子繁殖
[0035]开启表达重组禽干扰素α的BL21/ρΕΤ-32 a -rChIFN α工程菌的冻干菌种I支，加ImL无菌生理盐水溶解成菌悬液，划线接种于LB固体培养基平板，37°C培养24小时，挑取单个菌落，接种于LB固体培养基斜面，37°C培养24小时，用5mL LB液体培养基洗下菌苔得菌液，加入30%菌液体积的无菌甘油，定量分装成ImL/瓶，制得一级BL21/ρΕΤ-32 a -rChIFNa工程菌生产种