联合鉴定小麦对Bipolaris sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于农作物病害检测技术领域，具体涉及一种联合鉴定小麦对小麦根腐平 脐懦孢Bipolaris sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性的方法。 二、
【背景技术】：
[0002] 黑胚病与叶枯病是小麦的常见病害，黑胚病是指小麦颖果表面有不同形状和程度 的黑色、褐色等病变；叶枯病是小麦叶斑和叶枯病害的总称，这两种病的病因复杂，小麦根 腐平脐懦孢（Bipolaris sorokiniana即B. sorokiniana，中文名称还可称为"小麦根腐病 菌"）能同时引起这两种小麦病害，其感染小麦籽粒引起黑胚病，侵染叶片会引起小麦叶枯 病。
[0003] 蠕孢叶枯病在一般的年份可使小麦减产5~20%，严重者减产50 %以上（参见 朱修涛、常适滔、周春元，小麦叶枯病（HLB)研究进展；农业科技与装备，2010,8:15-18)，小 麦黑胚病的严重程度随品种、地点、年份及防治措施等因素的不同而变化，各国报道的发病 率一般在〇.3~66.7%之间变化（参见：1、1^〇丫，〇1112，^3即￥]\1，511611(：(：，0皿112 B, and Niu J S.Screening wheat genotypes for resistance to black point and the effects of diseased kernels on seed germination. Journal of Plant Diseases and Protection, 2014, 121(2) :79-88 ;2、Sissons M, Sissons S,and Egan N. The black point status of selected tetraploid species and Australian durum wheat and breeding lines. Crop Science, 2010, 50:1279-1286. 3、康业斌，郭秀撲，成玉梅，刘顺通，谢贞?小 麦对黑胚病的抗性及黑胚对种质的影响，麦类作物，1998, 4:28-31)。蠕孢菌引起的黑胚病 不仅使小麦穗粒数减少、千粒重降低从而影响小麦产量，而且降低籽粒品质，从而影响农民 收入，可见蠕孢黑胚病与叶枯病给小麦生产带来严重的危害。
[0004] 准确、高效的品种抗性鉴定技术是抗病遗传研究、抗病育种和病害防治的基础。目 前，小麦品种对黑胚病与叶枯病抗性的鉴定方法主要是基于大田自然发病率。然而，这两种 病的发生受病原种类与环境条件等多种因素的影响，同一品种在不同年度、不同地点的发 病程度变化很大。所以，基于自然发病情况评价品种抗性的稳定性较差，鉴定结果的可靠 性差。虽然也有一些针对黑胚病与叶枯病的接菌鉴定方法的报告，如康业斌等（康业斌， 刘顺通，成玉梅，段爱菊.小麦对黑胚病的抗性及黑胚对产量损失的影响，植物保护，1999， 3:25-27.)在小麦不同生育期（抽穗期、扬花初期、扬花末期和灌浆初期）接种麦类根腐叶 枯病菌（Drechlera sorokiniana)评价小麦对黑胚病抗性及该病对产量的影响，不过接菌 后的保湿时间短（连续3天，每天喷水2次保湿），马骥超（马骥超.小麦抗蠕孢菌叶枯病 微卫星标记检测.沈阳农业大学硕士学位论文，2007,中国，沈阳.）用离体叶片孢子液滴接 种法鉴定了小麦对B. sorokiniana叶枯病的抗性，由于实验室条件与大田有差异，故实验 室的鉴定结果不能充分反应小麦的大田抗性，更重要的是，这些研究将黑胚病与叶枯病两 种病害分开鉴定，效率较低。因此，非常有必要研究一种联合鉴定的方法，同时评价小麦对 这两种病害的抗性。 三、
【发明内容】
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[0005] 本发明要解决的技术问题是：根据目前小麦B. sorokiniana叶枯病与黑胚病 抗性分开鉴定、且小麦对黑胚病与叶枯病抗性鉴定方法存在的不足之处，本发明从接 菌时期与保湿时间这两个影响发病的主要因素入手，建立了一种能够同时鉴定小麦对 B. sorokiniana黑胚病与叶枯病害的方法；即本发明首次提供了一种联合鉴定小麦对 B. sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性的方法（一种用于联合鉴定小麦品/系对小麦根腐平 脐懦孢B. sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性的方法）。本发明技术方案是在小麦抽穗后套 硫酸纸袋隔离杂菌，开花后第6天进行孢子悬浮液喷洒接菌、换套塑料袋保湿7天后，再换 套硫酸纸袋，通过叶病斑面积与种子黑胚率同时评价小麦对B. sorokiniana叶枯病与黑胚 病抗性的方法。本发明鉴定方法与大田自然发病率鉴定相比，提高了鉴定结果的准确性与 可靠性，与两种病害分开鉴定相比，大大提高了鉴定的效率。
[0006] 为了解决上述问题，本发明采取的技术方案是：
[0007] 本发明提供一种联合鉴定小麦对小麦根腐平脐懦孢Bipolaris sorokiniana黑胚 病与叶枯病抗性的方法，所述联合鉴定方法包括以下步骤：
[0008] a、小麦根腐平脐懦孢Bipolaris sorokiniana的保存：将实验室分离的小麦根腐 平脐懦孢Bipolaris sorokiniana单孢菌株置于马铃薯葡萄糖琼脂PDA试管斜面培养基 上，于4°C冰箱保存备用；
[0009] b、小麦根腐平脐懦孢Bipolaris sorokiniana的孢子悬浮液的制备：将步骤a中 4°C冰箱保存的小麦根腐平脐懦孢Bipolaris sorokiniana切成0. 3cm2的块状，接种于马 铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上，在25°C条件下暗培养，培养后用载玻片从培养好的菌落上 将孢子刮下，采用蒸馏水冲洗、纱布过滤，得到孢子悬浮液，用血球计数板检测孢子悬浮液 的浓度，调整至孢子浓度为3 X 105个/mL，配置得到的孢子悬浮液放在溶液瓶中于4°C冰箱 保存备用；
[0010] c、喷洒接菌、套袋保湿：小麦抽穗后，采用硫酸纸袋将小麦穗部及旗叶套袋；在小 麦开花后第6天，将步骤b制备的Bipolaris sorokiniana孢子悬浮液摇勾，然后均勾喷洒 在小麦穗部及旗叶，喷洒后采用塑料袋将小麦穗部及旗叶罩住保湿，保湿7天后换套硫酸 纸袋；
[0011] d、鉴定结果记录：接菌后第15~18天记录叶片病斑面积占总叶片面积的百分比 即为病斑面积百分率，作为小麦叶枯病抗性的评价指标；小麦收获后晾晒干，手工脱粒，统 计黑胚籽粒占籽粒总数的百分比即为黑胚率，作为小麦黑胚病抗性的评价指标；
[0012] e、抗病性评价：根据步骤d记录所得病斑面积百分率和黑胚率来同时评价小麦对 小麦根腐平脐懦孢Bipolaris sorokiniana黑胚病与叶枯病的抗性。
[0013] 根据上述的联合鉴定小麦对小麦根腐平脐懦孢Bipolaris sorokiniana黑胚病与 叶枯病抗性的方法，马铃薯葡萄糖琼脂PDA的配制方法：
[0014] 首先准备好原料马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g和自来水1000mL，自然pH ; 将马铃薯洗净去皮切成小块，水沸后放入煮10~15分钟，然后用四层纱布过滤、除掉土 豆块，加入准备的葡萄糖和琼脂粉，继续加热搅拌混匀，冷却后再补足水分至lOOOmL ;分装 至15 X 150mm试管与250mL三角瓶中，121 °C灭菌20分钟后取出；试管摆斜面，冷却后用于 Bipolaris sorokiniana的保存；三角瓶中的培养基倒入9cm培养皿中，冷却后用于培养 Bipolaris sorokiniana〇
[0015] 根据上述的联合鉴定小麦对小麦根腐平脐懦孢Bipolaris sorokiniana黑胚病与 叶枯病抗性的方法，步骤b中Bipolaris sorokiniana在25°C条件下暗培养9~12天，培 养后菌丝基本布满培养皿，颜色深黑，产生大量孢子时取出培养皿，用灭菌载玻片将孢子轻 轻刮下，用蒸馏水冲洗培养皿2~3次，并用四层纱布过滤得到B. sorokiniana孢子悬浮 液。
[0016] 根据上述的联合鉴定小麦对小麦根腐平脐懦孢Bipolaris sorokiniana黑胚病与 叶枯病抗性的方法，步骤c中将步骤b制备的Bipolaris sorokiniana孢子悬浮液中加入 吐温-20摇勾，吐温-20的加入量占Bipol