弧菌检测引物组及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物检测技术领域，特别涉及一种弧菌检测引物组及检测方法。
【背景技术】
[0002] 弧菌是一类广泛分布于海洋环境的嗜盐性革兰氏阴性杆菌，隶属弧菌科，弧菌属， 具有丰富的多样性。现在有10多种是水产养殖中的病原菌，包括河流弧菌、鳗弧菌、溶藻弧 菌等。河流弧菌、鳗弧菌和溶藻弧菌均为条件致病菌，当水产养殖动物在不良的环境条件 下，遭遇不利刺激或是受伤时，会诱发疾病的产生。
[0003] 随着人工养殖迅速发展，养殖水域生态变化，弧菌病已经成为海水养殖动物主要 的细菌性病害之一。具有流行广、发病率高、危害大、死亡率高等特点，给鱼、虾、蟹及贝类等 海水动物的养殖造成了巨大的影响。有研究表明：当水中弧菌的数量为10 3-104cfu/mL时对 虾的红腿病症状明显加重，cfu/mL即每毫升样品中含有的细菌群落总数。河流弧菌、鳗孤菌 和溶藻弧菌能引起世界范围内的50多种淡海水养殖鱼类及其它养殖动物发生弧菌病。很 多研究表明，这三种弧菌是多种养殖对虾感染发病的重要原因。可以引起对虾红腿、黄鳃、 断须、额剑和尾部溃烂；对外界反应迟钝；部分虾体发黑和肌肉白浊。河弧菌肠、溶藻弧菌 还能使人治病，引起散发性腹泻。对弧菌引起的疾病的防治主要采取"预防为主、重点监测、 防治结合"的综合措施，有效地检测弧菌的方法将为弧菌的预防提供基本保障。
[0004] PCR检测法是检测弧菌的有效方法之一，但由于目前PCR检测的特异性不够，对弧 菌的检测容易受到不同致病菌或其他因素的干扰，容易产生非特异性扩增，更加无法对多 种弧菌进行同时检测，且检测灵敏度有限，当弧菌含量较低时无法及时检测出来，造成检测 效率偏低、准确性不够。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高的弧菌检测引物组及检测方法。
[0006] 本发明第一方面提供了检测弧菌的引物组，包括以下一对或多对引物：
[0007] toxR基因引物对：
[0008] 上游引物 toxR-F 序列为：TGCAAGTAAAGATCCTGATG，即序列表 SEQ ID No. 1 ;
[0009] 下游引物 toxR-R 序列为：GTCGTAAACAAAATGACACAA，即序列表 SEQ ID No. 2 ;
[0010] flaA基因引物对：
[0011] 上游引物 flaA-F 序列为：TTACGCAGAAGCGGTGAT，即序列表 SEQ ID No. 3 ;
[0012] 下游引物 flaA-R 序列为：GCTGITGGATGAAGGGTC，即序列表 SEQ ID No. 4 ;
[0013] pyrH基因引物对：
[0014] 上游引物 pyrH-F 序列为：AAAGAACTGGITGAACTGGGTG，即序列表 SEQ ID No. 5 ;
[0015] 下游引物 pyrH-R 序列为：CCATCAACITTCGTCGCTTT，即序列表 SEQ ID No. 6。
[0016] 本发明第二方面提供了一种检测弧菌的方法，所述方法包括使用以下一对或多对 引物对模板进行PCR扩增的步骤：
[0017] toxR基因引物对：
[0018] 上游引物 toxR-F 序列为：TGCAAGTAAAGATCCTGATG，即序列表 SEQ ID No. 1 ;
[0019] 下游引物 toxR-R 序列为：GTCGTAAACAAAATGACACAA，即序列表 SEQ ID No. 2 ;
[0020] flaA基因引物对：
[0021] 上游引物 flaA-F 序列为：TTACGCAGAAGCGGTGAT，即序列表 SEQ ID No. 3 ;
[0022] 下游引物 flaA-R 序列为：GCTGITGGATGAAGGGTC，即序列表 SEQ ID No. 4 ;
[0023] pyrH基因引物对：
[0024] 上游引物 pyrH-F 序列为：AAAGAACTGGITGAACTGGGTG，即序列表 SEQ ID No. 5 ;
[0025] 下游引物 pyrH-R 序列为：CCATCAACITTCGTCGCTTT，即序列表 SEQ ID No. 6。
[0026] 本发明的有益效果是：本发明分别以河流弧菌toxR基因，鳗弧菌的flaA基因和 溶藻弧菌的pyrH基因设计引物，采用PCR方法对水环境中弧菌进行检测，特异性强，并且 可以快速方便地确定致病菌的种类，实现对弧菌中的河流弧菌、鳗弧菌和溶藻弧菌的同时 检测及单独检测，提高了鉴定效率。本发明是直接利用活菌作为模板构建PCR体系，省去 了从细菌中提取DNA的步骤，操作更简单方便，成本更低。检测结果准确且灵敏度高，对 弧菌中的河流弧菌、鳗弧菌和溶藻弧菌可检测出的最低浓度依次达到5.21 X102cfU/mL、 2. 70X 104cfu/mL、2. 48X 102cfu/mL，对防止海水养殖动物主要细菌性病害之一的弧菌病具 有重要意义。
【附图说明】
[0027] 图1为toxR基因引物对、flaA基因引物对、pyrH基因引物对的特异性检验结果 示意图；其中，M为2000bp DNA分子量标准；1为河流弧菌模板与河流弧菌toxR引物对扩 增结果；2为鳗弧菌模板与河流弧菌toxR引物对扩增结果；3为溶藻弧菌模板与河流弧菌 toxR引物对扩增结果；4为副溶血弧菌模板与河流弧菌toxR引物对扩增结果；5为鳗弧菌 模板与鳗弧菌flaA引物对扩增结果；6为河流弧菌模板与鳗弧菌flaA-F引物对扩增结果； 7为溶藻弧菌模板与鳗弧菌flaA引物对扩增结果；8为副溶血弧菌模板与鳗弧菌flaA引物 对扩增结果；9为溶藻弧菌模板与溶藻弧菌pyrH引物对扩增结果；10为河流弧菌模板与溶 藻弧菌pyrH引物对扩增结果；11为鳗弧菌模板与溶藻弧菌pyrH引物对扩增结果；12为副 溶血弧菌活菌稀释液与溶藻弧菌pyrH引物对扩增结果。
[0028] 图2为对河流弧菌的灵敏度检测结果示意图；其中，M为2000bp DNA分子量标准； 1的河流弧菌浓度为5. 21 X 106cfu/mL ;2的河流弧菌浓度为5. 21 X 105cfu/mL ;3的河流弧 菌浓度为5. 21 X 104cfu/mL ;4的河流弧菌浓度为5. 21 X 103cfu/mL ;5的河流弧菌浓度为 5. 21 X 102cfu/mL ;6的河流弧菌浓度为5. 21 X lC^cfu/mL ;7的河流弧菌浓度为5. 21cfu/ mL ;8为空白对照组，即不含河流弧菌。
[0029] 图3为对鳗弧菌的灵敏度检测结果示意图；其中，M为2000bp DNA分子量标准；1 的鳗弧菌浓度为2. 70X 107cfu/mL ;2的鳗弧菌浓度为2. 70X 106cfu/mL ;3的鳗弧菌浓度为 2. 70X 105cfu/mL ;4 的鳗弧菌浓度为 2. 70X 104cfu/mL ;5 的鳗弧菌浓度为 2. 70X 103cfu/ mL ;6的鳗弧菌浓度为2. 70X 102cfU/mL ;7为空白对照组，即不含鳗弧菌。
[0030] 图4为对溶藻弧菌的灵敏度检测结果示意图；其中，M为2000bp DNA分子量标 准；1的溶藻弧菌浓度为2.48X107cfu/mL;2的溶藻弧菌浓度为2.48X 106cfu/mL;3的 溶藻弧菌浓度为2. 48X 105cfU/mL ;4的溶藻弧菌浓度为2. 48X 104cfU/mL ;5的溶藻弧菌 浓度为2.48X 103cfu/mL ;6的溶藻弧菌浓度为2.48X 102cfu/mL ;7的溶藻弧菌浓度为 2. 48X lOkfu/mL ;8为空白对照组，即不含溶藻弧菌。
[0031] 图5为同时对河流弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌中的任意两种弧菌或三种弧菌进行检 测的结果示意图；其中，M为2000bp DNA分子量标准；1为flaA基因引物对、toxR基因引物 对和pyrH基因引物对对PCR模板进行多重PCR扩增的结果；2为f laA基因引物对和toxR 基因引物对对PCR模板进行双重PCR扩增的结果；3为toxR基因引物对和pyrH基因引物对 对PCR模板进行双重PCR扩增的结果；4为f laA基因引物对和pyrH基因引物对对PCR模 板进行双重PCR扩增的结果；5为空白对照，即不采用引物进行PCR扩增的结果。
【具体实施方式】
[0032] 本发明第一方面提供了检测弧菌的引物组，包括以下一对或多对引物：
[0033] toxR基因引物对：
[0034] 上游引物 toxR-F 序列为：TGCAAGTAAAGATCCTGATG，如序列表 SEQ ID No. 1 所示；
[0035] 下游引物 toxR-R 序列为：GTCGTAAACAAAATGACACAA，如序列表 SEQ ID No. 2 所示；
[0036] flaA基因引物对：
[0037] 上游引物 flaA-F 序列为：TTACGCAGAAGCGGTGAT，如序列表 SEQ ID No. 3 所示；
[0038] 下游引物 flaA-R 序列为：GCTGITGGATGAAGGGTC，如序列表 SEQ ID No. 4 所示；
[0039] pyrH基因引物对：
[0040] 上游引物pyrH-F序列为：AAAGAACTGGITGAACTGGGTG，如序列表 SEQ ID No. 5 所示；
[0041] 下游引物 pyrH-R 序列为：CCATCAACITTCGTCGCTTT，如序列表 SEQ ID No. 6 所示。
[0042] 本发明第二方面提供了一种检测弧菌的方法，其特征在于：所述方法包括使用以 下一对或多对引物对模板进行PCR扩增的步骤：
[0043] toxR基因引物对：
[0044] 上游引物 toxR-F 序列为：TGCAAGTAAAGATCCTGATG，如序列表 SEQ ID No. 1 所示；
[0045] 下游引物 toxR-R 序列为：GTCGTAAACAAAATGACACAA，如序列表 SEQ ID No. 2 所示；
[0046] flaA基因引物对：
[0047] 上游引物 flaA-F 序列为：TTACGCAGAAGCGGTGAT，如序列表 SEQ ID No. 3 所示；
[0048] 下游引物 flaA-R 序列为：GCTGITGGATGAAGGGTC，如序列表