白木香的双重pcr鉴定方法、引物和探针的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及木材材种鉴定的生物学检测领域，具体地说涉及对白木香的DNA鉴定方法及其专用的引物和探针。
[0002]
【背景技术】
[0003]白木香(sinensis(Lour.))，又称土沉香，是瑞香科沉香属双子叶常绿乔木，国家二级重点野生保护植物。白木香不仅是珍贵的药用植物而且还有极高的经济价值。随着人们对沉香需求量的正价，沉香价格不断攀升，市场上出现了大量的伪品，严重扰乱了市场秩序。但迄今为止，对白木香的鉴定依然采用传统的木材鉴定手段，即解剖切片观察木材的构造以及形态特征从而得出判定结果。
[0004]所谓传统的木材鉴定识别方法是利用人工经验进行识别，主要通过对木材截面进行人工观察的方式完成。对白木香的鉴定目前采用的也是传统的鉴定方法。所谓的传统鉴定方法主要依赖宏观识别，而微观识别则需要使用光学显微镜观察其内部的解剖结构特征，也就是观察构成木材的各类细胞与组织的形态及排列特征，该方法涉及的识别特征较多，鉴定相对准确，但对于鉴定工作者的要求很高，要对此做出准确的鉴定，必须具有丰富的实践经验。近年来研究工作者开发了基于数字图像处理的木材图像识别技术，大大提高了木材识别的准确性，推动了木材识别技术的发展。但是，无论是基于识别者经验的传统识别技术还是基于计算机图像检索的识别技术，都没有脱离木材本身的形态结构及特征，鉴定识别工作都必须建立在所检木材有完整易辨识的形态结构的基础上，这就为木材识别工作带来了一定的局限性，同时，相近种属木材易出现材质结构的相似，为木材识别的准确性带来困难。
[0005]若能建立起以木材基因多样性的分子鉴定技术，一方面可以杜绝木材制品的掺假造假行为，对于保护消费者权益，提高品牌价值，规范木材市场；另一方面，为检验检疫、农林、工商的快速筛查和鉴定提供技术方法，促进物种资源的保护和利用，提高进出口的检验检疫的准确性。
[0006]因此建立起白木香的DNA鉴定方法，实现白木香的简单、快速、准确、客观的鉴定是目前急需解决的问题。
【发明内容】
[0007]本发明提供一种白木香鉴定的双重PCR引物和探针，所述引物和探针序列包括: 第一轮PCR扩增的引物和探针分别为:
HH Primer-F:5’- CCCGTTCGCTACTTTGACTTTG -3’
HH Primer-R:5’- CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT -3’
HH Primer Probe:5' -VIC- TGACATAGACACAAGTC -MGB-3’。
[0008]第二轮PCR扩增的引物和探针分别为:BMX Primer-F:5’- GAGTAAGGAATACCCATTTGAATGATT -3’
BMX Primer-R:5’- GCGAACGGGAATTGACAGAA -3’
BMX Primer Probe:5’-FAM- AAAGTCGTCCCTTCGA -MGB-3’。
[0009]进一步地，所述引物和探针的PCR反应条件为95°C，10min ;95°C 15s，60°C lmin，共40个循环。
[0010]进一步地，所述引物和探针的使用浓度比为:JZHT Primer-F: JZHTPrimer-R:JZHT Primer Probe= 900nM:900nM:250nM。
[0011]本发明还提供了白木香鉴定的双重PCR，包括如下步骤:
(1)木材样本的预处理；
(2)提取经(I)处理后的木材样本中的DNA;
(3)利用引物HH Primer-F 和 HH Primer-R,以及探针 HH Primer Probe 对(2)中提取的DNA进行第一轮的PCR扩增；
(4)根据(3)的第一轮PCR扩增结果，利用BMXPrimer-F和BMX Primer-R,以及探针BMX Primer Probe对(3)有扩增曲线的样本进行第二轮PCR扩增；
(5)根据(4)的结果确定木材种类；
其特征在于，所述引物和探针序列包括:
HH Primer-F:5’- CCCGTTCGCTACTTTGACTTTG -3’
HH Primer-R:5’- CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT -3’
HH Primer Probe:5' -VIC- TGACATAGACACAAGTC -MGB-3’
BMX Primer-F:5’- GAGTAAGGAATACCCATTTGAATGATT -3’
BMX Primer-R:5’- GCGAACGGGAATTGACAGAA -3’
BMX Primer Probe:5’-FAM- AAAGTCGTCCCTTCGA -MGB-3’ 。
[0012]进一步地，所述的荧光PCR 扩增条件为:95°C，10min ;95°C 15s，60°C lmins，共 40个循环。
[0013]本发明与现有技术相比具有以下优点和效果:本发明在对白木香大量基因信息进行分析比较的基础上，根据序列位点多态性，设计出白木香种属一对特异性扩增引物及MGB探针建立了白木香特异性的荧光定量PCR鉴定检测方法。该方法对目的基因进行扩增，条件依赖少，不用比对复杂的测序图谱，直接根据扩增曲线即可做出分析该位点基因型，对结果的分析非常直观。本发明所采用的荧光定量PCR法(MGB探针)检测周期短，在三个小时内即可得出结果，而且相对于DNA测序法来说检测灵敏度大大提高，使用MGB探针还能极大地降低本底信号的干扰。
[0014]本发明并不需要木材有完整的形态结构，只需从木料上取极少量木材样本，即可满足检测要求，操作简单。并且通过木材特有的DNA信息做出判断，鉴定过程客观、准确。克服了传统鉴定方法主要依赖于形态鉴定方法，并必须建立在木材有完整易辨识的形态结构的基础上的技术局限性。本发明很好地满足各相关部门对白木香快速筛查和鉴定的要求，能有效杜绝白木香制品的掺假造假行为，对于保护消费者权益，提高品牌价值，规范市场，促进物种资源的保护和利用具有重要的意义。
【附图说明】
[0015]图1是白木香和对照组树种DNA提取效果实验。
[0016]图2A和图2B是特异性实验结果。
[0017]图3是本发明方法灵敏度实验结果。
[0018]图4是取自针对经不同处理方式得到的木材样本的检测结果。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但并不因此将本发明限制在所述的具体实施例中。实施例中未说明的条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法:譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照商品说明书建议的步骤和条件。
[0020]实施例1检测白木香的引物、探针和检测试剂盒
利用NCBI等资源信息，筛选出一对特异性扩增引物对(HH Primer-F和HHPrimer-R)，并在该引物对的扩增区域设定了一条特异性的探针(HH Primer Probe)。利用 HH Primer-F、HH Primer-R 和 HH Primer Probe 将白木香(A.sinensis)和云南沉香(A.yunnanensis)与其他物种区分开来。所述扩增引物对和探针序列分别是:
HH Primer-F:5’- CCCGTTCGCTACTTTGACTTTG -3’
HH Primer-R:5’- CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT -3’
HH Primer Probe:5' -VIC- TGACATAGACACAAGTC -MGB-3’。
[0021]设计一对特异性扩增引物对(BMX Primer-F和BMX Primer-R)和一条特异性的探针(BMX Primer Probe)。利用 BMX Primer_F、BMX Primer-R 和 BMX Primer Probe 鉴定出白木香(A.sinensis)。
[0022]BMX Primer-F:5’- GAGTAAGGAATACCCATTTGAATGATT -3’
BMX Primer-R:5’- GCGAACGGGAATTGACAGAA -3’
BMX Primer Probe:5’-FAM- AAAGTCGTCCCTTCGA -MGB-3’ 。
[0023]一种检测白木香的试剂盒，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂、qPCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
[0024]其中所述用于将白木香(A.sinensis)和云南沉香(A.yunnanensis)与其他物种区分开的第一轮qPCR扩增反应体系为:20μ1的体系包括:
Taqman getyping master mix (2X ) 10μ1 HH Primer Probe终浓度(250nM)
HH Primer-F (20μΜ)终浓度(9OOnM)
HH Primer-R (20μΜ)终浓度(9OOnM)
DNA样品模板l~20ng
其中所述引物和探针序列分别为:
HH Primer-F:5’- CCCGTTCGCTACTTTGACTTTG -3’
HH Primer-R:5’- CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT -3’
HH Primer Probe:5' -VIC- TGACATAGACACAAGTC -MGB-3’。
[0025]其中所述用于鉴定出白木香(A.sinensis)的第二轮qPCR扩增反应体系为:20μ1的体系包括:Taqman getyping master mix (2X ) ΙΟμΙ
BMX Primer Probe终浓度(250nM)
BMX Primer-F (20μΜ)终浓度(900nM)
BMX Primer-R (20μΜ)终浓度(900nM)