用于检测aldh2基因的引物、探针及检测方法

文档序号:9411639阅读:870来源:国知局
用于检测aldh2基因的引物、探针及检测方法
【技术领域】:
[0001] 本发明涉及检测人血液样本中ALDH2基因多态性的引物、探针及其检测方法,属 于分子生物学领域。
【背景技术】:
[0002] 乙酸脱氢酶(aldehyde dehydrogenase gene, ALDH)是一组 NAD (P) + 依赖性酶,广 泛参与由体内乙醇、氨基酸、生物胺、维生素、类胆固醇及脂质的代谢过程中产生的醛类物 质的氧化反应,成为相应的羧酸,对减轻醛类物质对机体的毒性作用具有重要意义。ALDH有 19种同工酶,常见的有ALDH1~ALDH4,其中以位于线粒体内的ALDH2活性最强,在清除体 内醛类物质中起主要作用。ALDH2的活性变化与ALDH2基因多态性有关,突变的等位基因形 成人群中三种基因型:具有正常催化活性的野生纯合子型ALDH2*1/*1 ;催化活性下降的杂 合子型ALDH2*l/*2 ;催化活性丧失的突变纯合子型ALDH2*2/*2。在亚洲人群中,ALDH2*2 是频率最高且最重要的突变型,其中研究显示中国人ALDH2*2的频率达18%。
[0003] 研究表明,ALDH2基因多态性与硝酸甘油疗效、酒精代谢解毒能力和多种疾病的发 生均有影响。
[0004] ALDH2基因多态性与硝酸甘油的用药有关:舌下含服硝酸甘油片是抗冠心病心绞 痛急性发作的常规首选方法,但有些患者服用后并无疗效。ALDH2酶是硝酸甘油有效代谢 物N0形成的关键,当ALDH2基因在rs671位点突变后,酶活性降低,硝酸甘油在体内生物转 化过程受阻,有效活性产物N0生成减少,进而导致硝酸甘油治疗心绞痛效果降低。因此, ALDH2基因多态性检测有助于临床上指导硝酸甘油的合理利用,对实现个体化治疗具有重 要意义。
[0005] ALDH2基因多态性与酒精性肝病的关系:ALDH2 (Glu504Lys)基因突变使乙醛脱氢 酶活性也降低10倍以上,使酒精在体内从乙醇一乙醛一乙酸一水、二氧化碳的代谢过程受 阻,大量乙醛滞留在体内。加之高频饮酒易引发酒精依赖现象,进一步加重了肝脏的受累程 度。长期大量饮酒会导致脂肪肝甚至酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化,严重危害人民健康。 对ALDH2基因多态性的检测将有助于揭示个体酒精代谢能力,指导检测者正确饮酒,预防 酒精性肝病。
[0006] ALDH2基因多态性与食道癌和口腔癌等的关系:除了损伤肝脏导致脂肪肝、肝硬 化,甚至肝癌,还与增加食道癌、咽癌和胃癌、结肠癌、肺癌等风险相关。研究显示,携带 ALDH2突变等位基因的亚洲人因酗酒引发消化道癌症的几率明显较大:胃癌、结肠癌、肺癌 为3~10倍;咽癌、食道癌为11~115倍;而食道癌、咽癌和肺癌同时发病的几率增加了 50倍。ALDH2基因的检测将为食道癌、咽癌和胃癌、结肠癌、肺癌等相关尚风险疾病的提不 提供有效的参考依据。
[0007] 目前市场上常用的ALDH2基因检测方法有基因芯片法和PCR-RFLP,基因芯片法是 目前市场上应用最多的一种方法,最大的优点是高通量,但也存在着不足之处:技术成本昂 贵、操作复杂、检测灵敏度较低及重复性差等。PCR-限制性片段长度多态性技(PCR-RFLP) 操作繁琐、耗时多、结果可信度低等缺点,未能普及。因此,本领域亟需一种快速、高效、准 确、便捷、灵敏度高且结果准确性好的ALDH2基因型检测试剂。

【发明内容】

[0008] 为了克服现有技术检测能力有限,现提供一种多色荧光PCR检测ALDH2基因的方 法。
[0009] 本发明是采用多色荧光PCR检测ALDH2基因的方法:利用杂合子型ALDH2*l/*2、 纯合子型ALDH2*2/*2和内参基因0 -珠蛋白的引物探针配制PCR反应液,加入人全血样本 DNA,通过荧光PCR仪检测ALDH2基因的多态性。
[0010] 以上所述的引物探针序列如下:
[0011] ALDH2-F : 5,-CCAACAGGCCCTGAGCC-3 '
[0012] ALDH2-R : 5 ' -CACCCTTTGGTGGCTACAAGATG-3 '
[0013] HBB-F1 :5' -TGAAGGCTCATGGCAAGAAAGT-3'
[0014] HBB-F2 :5, -TTGTCACAGTGCAGCTCACTCA-3'
[0015] P-ff :5, -FAM-ACAGTTTTCACTTCAGTGTATGCCTGCAG-BHQl-3 ,
[0016] P-M : 5 ' -HEX-AGTTTTCACTTIAGTGTATGCCTGCAG-BHQ1-3 '
[0017] HBB-P : 5 ' -R0X-ACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCAC-BHQ2-3 '
[0018] 本发明的主要原理:本发明基于焚光PCR方法结合Taqman多色焚光探针技 术,采用三色荧光PCR和dUTP/UNG防污染措施在全封闭的扩增体系,以ALDH2*l/*2和 ALDH2*2/*2作为检测目标,同时针对人的珠蛋白基因(HBB)保守区域设计特异性引物 和探针作为内参对样本的采集、DNA的提取及扩增进行监控。将同一样本进行1管PCR扩 增即可同时检测出ALDH2基因的多态性,为硝酸甘油的用药、饮酒指导及相关高风险疾病 的提不提供有效的参考依据。
[0019] 本方法与现有技术相比具有以下优势:
[0020] (1)检测特异性探针对靶基因进行识别,准确性高。同时,靶序列由引物和探针双 重控制,特异性好、假阳性低。
[0021] (2)灵敏度为0.01%,8卩10000个细胞中有一个含八0)112基因八0)112*1/*2多态性、 ALDH2基因ALDH2*2/*2多态性就可以被检测出。
[0022] (3)简便安全:操作简单、安全、能防止污染。扩增和检测可以在同一管内检测,不 需要开盖,不易被污染;同时扩增和检测一步完成,不需要后期处理。
[0023] (4)全程监控:本发明实施例提供的试剂盒引入了内部阳性控制质量控制体系, 对检测过程进行全程质量监控,有效避免假阳性或者假阴性。
[0024] (5)快速:速度快、可在100分钟内完成。
【附图说明】:
[0025] 图1显示ALDH2基因ALDH2*l/*2多态性在PCR反应液中的扩增曲线;
[0026] 图2显示ALDH2基因ALDH2*2/*2多态性在PCR反应液中的扩增曲线;
[0027] 图3显示ALDH2基因无ALDH2*l/*2多态性和ALDH2*2/*2多态性时,在PCR反应 液中的扩增曲线。
【具体实施方式】:
[0028] 附图1显示ALDH2基因ALDH2*l/*2多态性在PCR反应液中的扩增曲线,其中,横 坐标为PCR循环数,纵坐标为荧光值;
[0029] 附图2显示ALDH2基因ALDH2*2/*2多态性在PCR反应液中的扩增曲线,其中,横 坐标为PCR循环数,纵坐标为荧光值;
[0030] 附图3显示ALDH2基因无ALDH2*l/*2多态性和ALDH2*2/*2多态性时,在PCR反 应液中的扩增曲线,其中,横坐标为PCR循环数,纵坐标为荧光值
[0031] 下面结合具体实施例,对本发明进一步说明,但发明的保护范围并不限于此。
[0032] (1)引物探针的设计
[0033] 根据GenBank所提供包含线粒体乙醛脱氢酶-2多态性位点上下游各lOOObp的 DNA序列进行分析,利用分子生物学软
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