一种稻属12个物种的基因组bac同源区筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域的基因组BAC (细菌人工染色体）同源区筛选方 法，特别涉及一种通过特殊设计的方案进行两轮southern杂交来筛选基因组BAC同源区的 方法。
【背景技术】
[0002] 对包含二倍体、四倍体等不同基因组类型在内的亲缘关系较近的多个植物物种开 展基因组比较研究是了解植物基因与基因组发展、进化的有力手段。多个物种整个基因组 的比较能对所分析物种得出比较全面的认识，但因全基因组信息量的巨大使得对比较重要 的某些基因位点分析欠详细。农业生产上包含水稻、小麦在内的绿色革命都是由于少数几 个关键基因的利用而引发的，如由于水稻、小麦资源中少数几个矮杆基因的开发利用而引 发了第一次"绿色革命"；野生稻资源中"野败"的发现与应用对我国的杂交水稻取得巨大 的成功起着关键的作用。但是，小麦-黑麦1BL/1RS易位系的利用历史表明，虽然1RS上抗 三种锈病基因（及抗白粉病基因（乃访)使普通小麦的抗病性得到了很好的 遗传改良，但1RS上所携带的不良基因使易位系小麦的加工品质变劣，面团耐揉性减弱、面 团发黏等问题。如何搞清重要性状基因区基因组成？是否有不利基因连锁？是否存在重要 性状基因的保守调控位点？等等，这些问题的解决需要开展近缘物种间重要功能基因所在 同源区的比较研究。
[0003] 基因组BAC文库是进行基因组BAC同源区研究的必要资源。迄今为止，众多生物中 已经构建了大量的基因组BAC文库。分蘖是水稻、小麦等禾本科作物所具有的一个重要农 艺性状，与创建理想株型密切相关，因而广受世界各国广泛关注。BAC文库筛选可以有PCR 法、southern杂交法等多种方法。粳稻日本晴中分蘖控制基因（#(尤7)已被成功克隆。针对 #(尤7及其所在BAC同源区采用特殊设计的方案进行两轮southern杂交方法来筛选#(967所 在稻属12个物种的同源区BAC，目前尚未见有专门报道。本发明所介绍的方法解决了如何 从12个栽培稻的近缘物种的基因组BAC文库中快速有效的进行同源序列区尽可能长的基 因组BAC筛选问题。
【发明内容】
[0004] 本发明通过特殊设计的方案采用两轮southern杂交的方法实现了 所在稻属 12个物种的同源区BAC的筛选。
[0005] 1野生稻基因组BAC文库的第一轮筛选。
[0006] 本发明所用的BAC文库涵盖了稻属12个物种、10种不同的基因组类型（AA、BB、 CC、EE、FF、GG、BBCC、CCDD、HHJJ、HHKK)(见表 2)。
[0007] 1.1关于"锚定探针"。
[0008] 本发明"锚定探针"即麗尤7,为单外显子基因（图1A)，水稻基因组只有单拷贝，位 于水稻6号染色体的长臂上（图1E)，属于GRAS转录因子基因家族（图1D)-员。从蛋白结 构上看，该基因家族在N端富于变化而C端很保守。为保证southern杂交的特异性本发明 特在#<967编码区的5'端即蛋白质多肽链的N端设计引物（引物序列见表1)进行探针片段 的扩增（图1A)。扩增（图1B)及测序结果（图1C)表明#067探针制备良好。
[0009] 1.2野生稻基因组BAC文库第一轮筛选结果。
[0010] 用"锚定探针"#(尤7以Southern杂交的方法对野生稻基因组BAC文库进行初步筛 选，共筛选到195个阳性BAC克隆(表2)。其中筛选到阳性BAC克隆最多的是HHKK基因组 型的(9. coarc (a te，筛选到22个，最少的是BB基因组型的（9. (a te，只筛选到8个。 这是符合预期结果的，异源四倍体基因组因含有2个#<967位点，故应筛选到较二倍体多约1 倍的阳性BAC克隆。值得注意的是，同是二倍体基因组如CC和BB，筛选到的阳性BAC克隆 数目相差1倍(前者16个，后者8个)，这暗示该2个二倍体基因组在#<967同源区历iJ/// 的酶切位点存在较大差异，前者（CC组）应该比后者（BB组）存在更多的历>^///酶切位点。
[0011] 表1用于BAC克隆筛选的探针引物序列。
[0012]
[0013] 表2麗?67探针从野生稻BAC文库中筛选到的阳性克隆。
[0013]
[0014] 2对第一轮筛选出的阳性BAC的第二轮筛选。
[0015] 第一轮筛选得到的阳性BAC克隆很多，以麗?67在这些BAC中的位置来看，可以将 它们分成3类，8卩#067中间型、#067偏左型、#067偏右型。本发明预从这些BAC中鉴定出 稻属植物各基因组类型的#<尤7中间型的同源BAC，以利于进行#<967及其上、下游基因在稻 属植物中进化演变的比较分析。故本发明又设计了 上游2个、下游3个基因的探针(供 参考的日本晴BAC中#(967位于中间偏左)，用来对第一轮筛选的阳性BAC作进一步筛选。第 二轮筛选探针的分布见图2,引物序列见表1，PCR扩增结果见图3 (探针776未用）。
[0016] 将第一轮筛选得到的阳性BAC克隆用办hJ///酶切后转膜，之后用第二轮筛选探针 进行Southern杂交，结果见图4~图6 (为了节省篇幅仅将二倍体、四倍体部分杂交结果图 列出）。
[0017] 3筛选结果。
[0018] 根据不同探针杂交的模式（pattern)进行综合判断，最后选出的BAC克隆及其探 针分布情况见图7及表3。从图7可以看出，选出的BAC克隆多数符合预期目标，少数克隆 有些偏向下游。结果表明，在同属不同物种植物间进行重要基因直向同源区BAC筛选时采 用两轮southern杂交法筛选是简单可行的。
[0019] 表3最终选定的野生稻各基因组类型BAC文库中#(967同源BAC及编号。
[0020]
【附图说明】
[0021] 图1关于探针的信息。
[0022] #<967探针的扩增区域(A，灰色方框)、扩增结果（B )、测序结果与模板序列的比对 (C，上部为测序结果，下部为模板序列)、所属基因家族蛋白质结构特征（D，不同大小及灰色 的长方框表示该蛋白的Motif构成，其上字母或罗马数字表示该Motif的名称，图的左侧所 列为该蛋白的名称，灰色箭头所示表示#<尤7的N端)和染色体位置（E，箭头所示表示水稻6 号染色体着丝粒)。
[0023] 图2第二轮筛选探针在日本晴麗?67 BAC上的相对位置。
[0024] 图中UP、DP分别表示该探针在#(967的上游、下游；UP、DP前面的数字表示探针与 #(尤7位点间的相对距离（以kb为单位）；UP、DP后面的数字表示该探针的长度。
[0025] 图3第二轮筛选用探针的扩增结果。
[0026] 图4二倍体野生稻(9. 汾w BAC克隆的southern杂交第二轮筛选。
[0027] 根据不同探针的、不同杂交模式第19个BAC克隆被选定。
[0028] 图5二倍体野生稻ft BAC克隆的southern杂交第二轮筛选。
[0029] 根据不同探针的、不同杂交模式第7个BAC克隆被选定。
[0030] 图6四倍体野生稻(9. azi/wte BAC克隆的Southern杂交第二轮筛选。
[0031] 根据不同探针的、不同杂交模式第8个BAC克隆和第15个BAC克隆被选定；四倍 体因有2个同源位点故根据杂交模式应选取两个不同的BAC克隆。
[0032] 图7野生稻各基因组类型中选定BAC的探针分布。
[0033] 图上部表不探针名称；图右侧表不该BAC的编号，该编号所代表的克隆见表3。
[0034]
【具体实施方式】
[0035] 1 Southern 探针的制备。
[0036] 1. 1探针类型。
[0037] 分两种，一是"锚定探针"，用于对野生稻的BAC文库进行第一轮筛选；二是"限定 探针"，用于对第一轮筛选鉴定出来的阳性克隆进一步筛选。前者所用的是分蘖控制基因 #(967,后者是麗?67上游2个基因（距麗?67约42kb、53kb处各一个）的探针和下游3个基因 (距麗?67约42kb、52kb、62kb处各一个）的探针。
[0038] 1.2 探针 PCR 扩增。
[0039] 以梗稻日本晴（satiKa L. ssp. Ja/jonica cv. Nipponbare)的基因组DNA 为模板进行PCR扩增。引物序列见表1。
[0040] "锚定探针" #(967的扩增因其GC含量较高（>75%)，故使用GC缓冲液（GC buffer I，含5mmol/L Mg2+)，体系为：LA 7a濟每，0? 3yL ;2XGC buffer I，12. 5yL ;dNTP， 3yL;模板DNA 100 ng;引物4yL;加ddH20至25yL。扩增程序为：94°C，变性4min; (94°C，30s ;59°C，30s ;72°C，lmin) 30 次循环；72°C，延伸 5min ;4°C保存。
[0041] "限定探针"的扩增采用常规方式进行。体系为：普通ra濟每，0. 25 y L ;10Xbuffer (含 5mmol/L Mg2+)，2. 5yL ;dNTP，2yL ;模板 DNA 100ng ;引物 2yL ;加ddH20