一种棘腹蛙感染腐败希瓦氏菌的pcr检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于一种生物工程技术和生物医学领域，具体涉及一种检测棘腹蛙感染腐 败希瓦氏菌的检测试剂盒及检测方法，适用于棘腹蛙的感染腐败希瓦氏菌的检测。
【背景技术】
[0002] 棘腹蛙是一种营养丰富且具药用价值的大型山区食用蛙，其鲜肉干样中蛋白质含 量为16. 25%、脂肪含量为1.26%，具有丰富的滋补功效和药用价值，随着人民生活水平的 不断提高，棘腹蛙的食用价值也在逐渐上升，具有较好的开发前景。同时作为脊椎动物进化 中的过渡动物，是进行解剖学、遗传学和胚胎发育学研究较为理想的实验动物。由于环境 污染严重、野生栖息地遭受破坏、人类大肆捕杀等因素造成棘腹蛙野生种群数量大量减少； 为保护其野生资源，同时满足市场需求，棘腹蛙的人工养殖逐渐受到重视。但是，随着养殖 数量的不断增多，随之而来的多种病害对棘腹蛙养殖产业的发展产生严重威胁。感染蛙类 的病原菌主要有温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、链球菌等，可见棘腹蛙细菌性疾病是人工养 殖过程中常见且危害极大的一类疾病，对细菌性疾病的研究也是棘腹蛙人工养殖的一个重 点。目前还没有检测棘腹蛙感染腐败希瓦氏菌的报道。
[0003] 腐败希瓦氏菌在分类上属于不动杆菌属，是一种条件致病菌，一般在养殖环境恶 化、养殖种类体质下降等情况下才导致疾病发生；该菌株可导致水生动物肠道腐败、体表溃 疡、体内组织发生败血性病变。近年来，国内外有大量关于水生动物腐败希瓦菌的报道，在 鲤鱼、虹鳟、大黄鱼和大菱鲆上都有分离出并确定为优势菌株。由此可见，腐败希瓦氏菌给 水产养殖产业带来了巨大伤害。为了及早发现棘腹蛙是否被腐败希瓦氏菌感染，有必要建 立一种快速、准确、灵敏的检测方法。
[0004] CN102382888公开一种腐败希瓦氏菌的免疫磁珠-FQ-PCR检测方法，其特征在于 包括下述步骤：1)、抗体制备：将浓度为109cfu/mL的腐败希瓦氏菌液0. 20mL注射于小鼠 腹腔内首次免疫，间隔一周相同剂量的腐败希瓦氏菌液加强免疫一次，共加强免疫三次，每 次加强免疫的腐败希瓦氏菌液浓度为l〇l〇 Cfu/mL，最后一次加强免疫后第四天，摘除小鼠 眼球取血，血液置于37°C下温育0. 5h，4°C下3000r/min离心15min，取上清，得到腐败希 瓦氏菌抗体溶液；2)、免疫磁珠制备：取48mg的Fe304磁珠先后用乙醇和双蒸水超声清洗 干净，用双蒸水定容至20mL得磁珠溶液，在10mL磁珠溶液中，加入质量浓度为10%戊二 醛溶液2mL，室温下搅拌3h，固液分离后用磷酸吐温缓冲液清洗磁珠，所述磷酸吐温缓冲液 中由磷酸缓冲液与吐温20配制而成，所述磷酸吐温缓冲液中所述吐温20的体积百分浓 度为0. 03~0. 07 %，再将清洗后的磁珠悬浮于2mL磷酸缓冲液中，所述磷酸缓冲液的pH 为7~7. 5,然后加入50 y L上述腐败希瓦氏菌抗体溶液，4°C下轻轻搅拌12h，得到腐败希 瓦氏菌免疫磁珠溶液，4°C保存备用；3)、待测样品富集：在盛有0. lmL的上述腐败希瓦氏 菌免疫磁珠溶液中加入lmL待测样品液，室温下轻缓旋转振荡30min，将试管置于磁性细 胞分离架上3min，移出管中液体，每次用1. OmL上述磷酸缓冲液清洗腐败希瓦氏菌免疫磁 珠，重复清洗3-5次，清洗完毕，加入0. 5~lmL无菌水，磁性分离，取出腐败希瓦氏菌免疫 磁珠后，得到富集的待检样品溶液；4)、模板DNA制备：将上述待检样品溶液，在100°C温度 下煮沸l〇min，12000r/min离心5min，取上清，得到模板DNA溶液；5)、PCR反应：取上述模 板DNA溶液5 y L，加入到由含有荧光染料的TaqTMII混合液10 y L、引物浓度为10 y M的 FQF引物溶液0. 5 y L、引物浓度为10 y M的FQR引物溶液0. 5 y L的反应体系中，用无菌水 定容至20yL，反应程序：95°C预变性5min ;94°C变性5s、50°C退火15s、72°C延伸15s，共 45个循环；PCR反应中若有荧光信号响应，待检样品溶液含有腐败希瓦氏菌；所述FQF引物 溶液含有序列为GTGAAACTCATTTGGGTTGTAT的特有性引物，所述FQR引物溶液含有序列为 CCGTTCGGAAATCGTTAG的特有性引物；6)、上述步骤1-5的方法为非诊断疾病的方法
[0005] CN103820544A公开一种检测水产品中腐败希瓦氏菌检测方法，包括如下步骤：a、 腐败希瓦氏菌的分离：无菌取鲜活水产样品l〇g，加入无菌蛋白胨生理盐水制成溶液，稀释 后涂布于大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA)上进行培养，挑取菌落，分别划线到铁琼脂平板上继 续培养，挑取黑色的菌落，收集细菌，抽提DNA ;b、PCR分离鉴定：提取待测的产硫化氢细菌 的基因组DNA，进行PCR扩增。扩增的引物对选自以下引物：第一引物对为一条引物的序列 为 F-CAGITGGGCCTITGATGCTT，记为 SEQIDN0. 1，另一条的序列为 R-CACAGAGGTCCCTTCATCGA， 记为SEQIDN0. 2 ;或者是第二引物对为一条引物的序列为F-TCAGGATAAAACATTACCATTGGA， 记为 SEQIDN0. 3,另一条的序列为 R-CCAGGAAAATCTTGGTGGAA，记为 SEQIDN0. 4。
[0006] 以上检测方法繁琐，特别是针对棘腹蛙，其检测棘腹蛙否被腐败希瓦氏菌感染缺 乏特异性和敏感性，针对棘腹蛙，有必要研究一种操作简单、快速、特异性和敏感性好的检 测试剂盒，用于检测。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种检测棘腹蛙感染 腐败希瓦氏菌的PCR检测试剂盒，该试剂盒用于检测棘腹蛙是否被腐败希瓦氏菌感染具有 良好的特异性和敏感性。能快速、高效地用于腐败希瓦氏菌的检测。
[0008] 本发明的一种检测棘腹蛙感染腐败希瓦氏菌的PCR检测试剂盒，包括2倍反应 混合缓冲液、Taq酶、上游引物S-F :5' - CCCCTATCCTTAITTGCC - 3'和下游引物S-R :5' -CTAGCGATTCCGACTTCAT - 3'。
[0009] 上述本发明的PCR检测试剂盒，还包含阳性对照液和阴性对照液，其中，所述阳性 对照液为感染腐败希瓦氏菌的棘腹蛙的基因组DNA ;所述阴性对照液为ddH20。
[0010] 上述本发明的PCR检测试剂盒，还包含灭菌的ddH20。
[0011] 上述本发明的PCR检测试剂盒，所述2倍反应混合缓冲液1. OmL，包含以下成分：
[0012] KC1 20mM, MgCh Tris-HCl, pH5.8 40mM， 碰TP. 2.,5mM。
[0013] 上述本发明的PCR检测试剂盒，所述上游引物S-F和下游引物S-R的浓度各为 10 y M/L，所述 Taq 酶为 5U/ y LTaq 酶。
[0014] 在一具体实施方案中，本发明的一种检测棘腹蛙感染腐败希瓦氏菌的PCR检测试 剂盒，包括2倍反应混合缓冲液、Taq酶、灭菌的ddH 20、阳性对照液、阴性对照液、上游引物 S-F : 5，_ CCCCTATCCTTATTTGCC _ 3，和下游引物 S-R : 5，_ CTAGCGATTCCGACTTCAT _ 3 '，其 中，
[0015] 所述2倍反应混合缓冲液1. OmL，包含以下成分：
[0016] KC! 20mM, MgCh 25mM, Tris~HCK pH5.8 40mM. dN丁P 2.5mMc
[0017] 在上述具体实施方案中，本发明的PCR检测试剂盒，所述阳性对照液为感染腐败 希瓦氏菌的棘腹蛙的基因组DNA ;所述阴性对照液为ddH20。
[0018] 在上述具体实施方案中，本发明的PCR检测试剂盒，所述上游引物S-F和下游引物 S-R的浓度各为10 y M/L，所述Taq酶为5U/ y L Taq酶。
[0019] 本发明还提供了一种采用本发明的PCR检测试剂盒检测棘腹蛙感染腐败希瓦氏 菌的方法，包括以下步骤：
[0020] (1)棘腹蛙DNA的提取：
[0021] ①取病蛙眼、口腔或胃，剪碎后置于匀浆器中，加入匀浆液后冰浴研磨，研磨碎裂 后置离心管中；
[0022] ②加入1 % -3%的0 -巯基乙醇溶液，混匀后60-70°C水浴0. 5-lh，每隔3-5分钟 取出摇匀一次；
[0023] ③10000-15000rpm离心3_7min，离心后，移出上清液液于另一无菌离心管中，弃 沉淀；
[0024] ④向上清液中加入等体积的按体积比20-30 :1的氯仿：异戊醇的混合溶剂，混匀 后，8000_12000rpm离心5_15min，取上清液至另一无菌离心管中；
[0025] ⑤加入等体积的氯仿，混勾后8000-12000rpm离心5-15min，再取上清液；
[0026] ⑥向上清液中加入0. 8-1. 2倍体积的2-4M NaAc溶液，混匀后再加入1. 5-2. 5倍 体积预冷的无水乙醇，充分混匀后-18°C以下放置30min以上；
[0027] ⑦10000-15000rpm离心3_7min，弃上清液，所得DNA沉淀在室温下瞭干；
[0028] ⑧用70-80 %的乙醇对DNA沉淀进行洗涤，干燥后沉淀溶于TE中，加RNase A，37°C 消化20-40min，得到棘腹蛙DNA后于-20°C保存。
[0029] (2)PCR反应体系：采用20yL的PCR反应体系，在0. 2mL PCR反应管内分别加入2 倍反应混合缓冲液10 y L，上游引物、下游引物各0.