一种无创产前筛查21-三体综合征试剂盒的制作方法

文档序号:9411666阅读:471来源:国知局
一种无创产前筛查21-三体综合征试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明关于核酸的测定或检验方法技术领域,尤其涉及一种无创产前筛查21-三 体综合征试剂盒。
【背景技术】
[0002] 21-三体综合征是胎儿最常见的染色体病,在新生儿中的发病率约为1/800,占小 儿染色体病的70-80%,发病率随着母亲年龄的增高而增高。目前我国大约有100万以上的 患者,平均20分钟就有一例21-三体综合征患儿出生,全国每年出生的21-三体综合征患 儿可多达27万例左右。21-三体综合征患者由于多了 1条第21号染色体,主要表现为智力 低下,发育迟缓和特殊面容。由于21-三体综合征给父母、家庭和社会带来了无可挽回的痛 苦和沉重的精神负担,因此对高龄孕妇等高危人群进行产前诊断尤为重要和必要。当前在 进行产前诊断时,必须采取创伤性的手段获取胎儿细胞样本如羊水或者绒毛组织,尽管这 些创伤性的手段相对比较安全,但是对胎儿和母亲仍然存在一定的风险,因此临床上只对 可能怀有遗传异常胎儿的高风险孕妇进行产前诊断。为了避免潜在的风险,在过去几十年 中,人们一直广泛应用的方法是从母血中分离胎儿有核红细胞,但是由于胎儿有核红细胞 在母血中含量稀少,需要进行细胞富集等种种操作程序限制了该方法的发展和实际应用。
[0003] 1997年香港中文大学卢煜明(Dennis Lo)教授发现,母体外周血中存在游离胎儿 DNA,大概在孕4周的时候含量很少,孕8周的时候明显增多,随孕周增加稳定存在,浓度约 3-13%,被认为主要来自胎盘,并在后数小时内从母体血液中清除。母体血中存在的胎儿游 离DNA,此重大发现的论文发表在1997年的《柳叶刀》杂志上(Lancetl997 ;350:485-87)。 从此开辟了无创产前研发的热潮,尤其是高通量测序技术为无创筛查在临床应用方面开辟 了先河。该技术通过抽取孕妇静脉血,提取到血清中胎儿游离DNA,利用新一代DNA测序技 术对母体外周血浆中的游离DNA片段(包含胎儿游离DNA)进行测序,并将测序结果进行生 物信息分析,可以从中得到胎儿的遗传信息。
[0004] 多重杂交特异扩增技术(Multiplex Hybri dization-specific Amplification, MHSA),是一种灵敏度极高的相对定量技术,它利用核酸杂交、连接反应和PCR扩增反应,可 以在同一反应体系内检测多达40个不同核酸序列拷贝数变化,其进行无创产前21-三体检 测原理是将制备的长型探针和短型探针同目的基因序列杂交,杂交后短探针的5' -端和长 探针的3'-端彼此能够通过连接酶连接成一条DNA片段。不匹配的探针杂交后不能被连接 酶连接。所有被连接的DNA序列都有共同的5'和3'末端,因此可以仅仅用一对引物在一 个PCR体系中扩增不同的目的基因序列。由于长型探针有片段大小可变的中间序列,因此 每对MHSA探针组可以扩增出特定片段大小的一段序列。通过电泳的方法即可以分辨出不 同的目的基因序列。
[0005] 上述的产前基因诊断有建立在羊膜腔穿刺、绒毛吸取等侵入性基础上进行的细胞 遗传学诊断,虽然诊断准确,但因其操作有创伤性,易引起宫内感染、流产、甚至对胎儿有一 定的影响,属于侵入性检查。而高通量测序方法和其它无创的方法虽然解决了侵入性带来 的问题,但是操作相对繁琐,灵敏度有待进一步提高。

【发明内容】

[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种无创产前筛查21-三体综合征试剂盒,该试 剂盒引物设计合理,可以实现21-三体综合征的无创产前筛查,准确率高,有效防止新患儿 出生,从根源上阻断有害基因下传,从而实现无创的预防。
[0007] 为解决上述技术问题,本发明所采取的技术方案是:一种无创产前筛查21-三体 综合征试剂盒,包括PCR反应液,PCR反应液中包含有探针和引物,所述探针为TaqMam UPL6-FAM探针和TaqMam UPL15-TET探针,TaqMam UPL6-FAM探针用于检测18号染色体, TaqMam UPL15-TET探针用于检测21号染色体,针对21号染色体设计20对相应的上游引物 与下游引物,进行合成,其基因序列为SEQ ID N0. 1-40;以及针对18号染色体设计20对相 应的上游引物与下游引物,进行合成,其基因序列为SEQ ID NO. 41-80;TaqMam UPL6-FAM 探针,其基因序列为SEQ ID NO. 81;TaqMam UPL15-TET探针,其基因序列为SEQ ID NO. 82〇
[0008] 优选的,PCR反应液中还包含有提取的孕妇外周血胎儿cfDNA、TaqMan Genotyping Master Mix、美国RainDace Technologies公司的液滴稳定剂和超纯水。液滴 稳定剂由Source仪器供应商美国RainDace Technologies公司提供。
[0009] 进一步有效地,PCR反应液中TaqMan Genotyping Master Mix的终浓度为1 X, 美国RainDace Technologies公司的液滴稳定剂的终浓度为1 X,上游引物的终浓度为 0. 5 y M,下游引物的终浓度为0. 5 y M,TaqMam UPL6-FAM探针的终浓度为0. 2 y M,TaqMam UPL15-TET探针的终浓度为0. 2 y M。
[0010] 采用上述技术方案所产生的有益效果在于: (1)本发明的试剂盒,引物设计合理,可以实现21-三体综合征的无创产前筛查,准确 率高,与目前医学上有创的诊断方法一一抽取羊水或绒毛膜等检测结果完全吻合,有效防 止新患儿出生,从根源上阻断有害基因下传,从而实现无创的预防。
[0011] (2)本发明采集孕妇外周血进行21-三体综合征的无创产前筛查,无需穿刺羊 膜腔和插入绒毛组织,对胎儿无任何创伤,安全可靠;且DNA起始量更低,CV值可以达到 0. 68%,准确度更高。
[0012] (3)本发明采用20重数字PCR单分子扩增,采用计数的方法进行定量,具有更高的 灵敏度。
[0013] (4)本发明操作简单快捷,缩短检测周期,仅需两天即可完成整个流程。
[0014] (5)本发明全封闭式检测,减少交叉污染。
【附图说明】
[0015] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明; 图1是本发明实施例2样本1孕妇外周血胎儿cfDNA进行数字PCR后探针荧光强度相 位图。
【具体实施方式】
[0016] 实施例中用到的仪器如下: Source 仪器:厂家为美国 RainDace Technologies 公司,型号为 RainDrop ;Source 仪 器用于PCR反应液的油包水微滴制备,Source仪器中文翻译为油包水制备仪; PCR仪:厂家为北京东胜创新生物科技有限公司,型号为ETC811的基因扩增仪;PCR仪 用于PCR反应液油包水微滴的扩增,得到PCR产物; Sense仪器:厂家为美国RainDace Technologies公司,型号为RainDrop ;Sense仪器 用于对PCR产物进行荧光信号检测,Sense仪器中文翻译为荧光信号检测仪。
[0017] 实施例1 一种无创产前筛查21-三体综合征试剂盒,包括PCR反应液,PCR反应液中包含有探 针和引物,探针为 TaqMam UPL6-FAM 探针和 TaqMam UPL15-TET 探针,TaqMam UPL6-FAM 探 针用于检测18号染色体,TaqMam UPL15-TET探针用于检测21号染色体,针对21号染色体 设计20对相应的上游引物与下游引物,进行合成,其基因序列为SEQ ID N0. 1-40;以及针 对18号染色体设计20对相应的上游引物与下游引物,进行合成,其基因序列为SEQ ID NO. 41-80 ;TaqMam UPL6-FAM 探针,其基因序列为 SEQ ID NO. 81 ;TaqMam UPL15-TET 探针,其 基因序列为SEQ ID NO. 82。
[0018] PCR反应液中还包含有提取的孕妇外周血胎儿cfDNA、TaqMan Genotyping Master Mix、液滴稳定剂和超纯水。
[0019]PCR 反应液中 Taq
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