基于pgr基因的猪繁殖性状相关的分子标记及其检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物分子育种领域，尤其涉及一种基于PGR基因的猪繁殖性状相关的 分子标记及其检测方法和应用。
【背景技术】
[0002] 分子标记辅助选择是基因工程在现代家畜育种中的一项重要应用，利用与育种性 状相关的各种标记代替以表型为基础的选择，从分子水平上分析个体的遗传组成，从而实 现对基因型的直接选择，可克服直接选择的弊端，提高选择的准确性和缩短世代间隔。
[0003] 总产仔数、产活仔数等猪的繁殖性状是重要的经济性状，直接关系到养猪业的经 济效益。
[0004] 孕酮是一种很重要的留体激素，在受孕和和维持妊娠中起关键作用，同时也是控 制排卵、子宫和乳腺发育的重要因素。孕酮的生理作用是通过孕酮受体（PGR)介导的，因 此，孕酮的生理效应不仅取决于孕酮本身的分泌和代谢，还与孕酮受体的表达与功能密切 相关。人的PGR基因定位于Ilq22_q23,含有8个外显子和7个内含子。PGR基因多态性研 究大部分集中在人和绵羊上。目前未见PGR基因与猪繁殖性状之间关系的研究报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种基于PGR基因的猪繁殖性 状相关的分子标记。本发明还提供了该分子标记的检测方法和应用。
[0006] 本发明所述的基于PGR基因的猪繁殖性状相关的分子标记，它为猪PGR基因片段， 所述的猪PGR基因片段含有多态性位点，所述的多态性位点为如SEQ ID NO. 1所示序列中 第1319位，所述的多态性位点具有C/T碱基的变异。
[0007] 序列表中SEQ ID NO. 1所示的序列为猪PGR mRNA序列，其第1319位为多态性位 点，与猪总产仔数、产活仔数紧密相关，可利用该位点开发与猪繁殖性状相关的分子标记。
[0008] 本发明所述的猪PGR基因片段的核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示；或所述的猪PGR 基因片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。当然，本发明所述的猪PGR基因片段也可以 为包含如SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列的DNA片段。根据检测方法，可以选择合适长度的 能够包含多态性位点的DNA片段。
[0009] 本发明还提供了所述的分子标记的检测方法，包括：
[0010] (1)根据所述的分子标记的核苷酸序列设计引物；
[0011] ⑵以待检测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增；
[0012] (3)判断PCR扩增产物中多态性位点的类型。
[0013] 步骤（3)中，可对PCR产物进行测序或电泳分析，判断多态性位点的碱基类型。
[0014] 优选的，步骤（1)中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0. 14所示，下游引物的核 苷酸序列如SEQ ID N0. 15所示。利用该引物，可采用错配PCR-RFLP的方法准确方便的检 测多态性位点的类型。
[0015] 作为另一种可选择的，步骤（1)中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0. 4所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0016] 本发明还提供了所述的分子标记在猪繁殖性状选择中的应用。
[0017] 具体的，猪可以为小梅山猪、楓泾猪或大白猪。繁殖性状为总产仔数或产活仔数。
[0018] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0019] 本发明研究发现，猪PGR基因第1外显子存在一个突变位点（即多态性位点），该 位点位于如SEQ ID NO. 1所示序列的第1319位，该突变位点与猪的繁殖性状尤其是总产仔 数或产活仔数相关，且容易检测，从而本发明根据该突变位点提供了一种基于PGR基因的 猪繁殖性状相关的分子标记，并提供了该分子标记的检测方法及在猪繁殖性状选择中的应 用，为猪分子育种、研究猪繁殖生理机制提供基础。
【附图说明】
[0020] 图1为实施例1猪PGR基因SNPs筛选结果；
[0021] 图2为实施例1猪PGR基因C1319T氨基酸序列比对结果；
[0022] 图3为实施例1错配PCR-RFLP的错配碱基与酶切位点分析结果；
[0023] 图4为实施例1猪PGR基因C1319T的错配PCR-RFLP检测部分样本的电泳图；
[0024] 图5为实施例1突变位点C1319T分型检测中AA基因个体的测序结果；
[0025] 图6为实施例1突变位点C1319T分型检测中BB基因个体的测序结果。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价 形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
[0027] 实施例1
[0028] 2013年采集106头小梅山猪、42头楓泾猪和70头大白猪的耳样；同时整理了江苏 农林职业技术学院小梅山猪育种中心2004年~2012年期间上述106头小梅山母猪的生产 档案，共有698窝仔猪记录，主要收集产仔年份、胎次、TNB、NBA等指标。耳样（约0. 15g) 用耳号钳采集，-20°C冻存。用常规的酚氯仿抽提法提取猪耳样的基因组DNA，对基因组DNA 进行0D值测定，计算其浓度，并用ddH 20稀释至终浓度为100ng/ y L，原液-20°C保存，稀释 液4°C保存。
[0029] 第一步：获取猪PGR基因外显子序列。
[0030] 根据GenBank中公布的人PGR基因全序列（登录号：AY525610. 1)和猪PGR mRNA 序列（登录号：NM_〇〇1166488. 1，序列如SEQ ID NO. 1所示），比对两者的蛋白质序列，确定 猪PGR基因外显子区域。猪PGR基因共8个外显子。
[0031] 第二步：应用生物软件设计引物，引物扩增覆盖外显子区域。
[0032] 采用Primerf. 0软件设计3对引物，扩增第1外显子区域。3对引物分别为： PGR-1. 1、PGR-1. 2、PGR-1. 3。引物基本信息见表 1。
[0033] 表1猪PGR基因引物序列
[0034]
[0035] 注：F代表上游引物，R代表下游引物。
[0036] 第三步：PCR扩增和产物测序。
[0037] 每个个体基因组DNA样本吸取5 y L进行混合，形成DNA池，混合后采用上述3对 引物进行PCR扩增，扩增产物直接送上海生工生物公司进行测序。
[0038] PCR 扩增反应体系为 20 y L，包括：10XBuffer 2. 0 y L、25mM Mg2+2. 2 y L、10mM dNTPs 0? 8 y L、10 y M 上、下游引物各 1 y L、DNA 模板 1 y L (lOOng)、5U ? y L taq 酶 0? 2 y L、 ddH20 11.8yL〇
[0039] PCR扩增反应程序：94°C预变性5min ;31个循环（94°C变性lmin，58°C~60°C退 火30s，72°C延伸lmin);最后72°C延伸10min，4°C保存产物。具体的退火温度根据表1中 的相应引物进行选择。
[0040] 第四步：序列比对，寻找突变位点。
[0041] 测序结果与GenBank公布的序列进行比对，寻找突变位点。结果发现仅在引物 PGR-1. 1所扩片段（PGR-1. 1扩增靶向序列如SEQ ID N0. 3所示）中存在1个SNP，即位于 第1外显子的1319位点的C - T的突变（图1)。
[0042] 第五步：对突变位点进行氨基酸比对分析和酶切位点分析。
[0043] 利用DNAMAN软件将SNPs所在的外显子核苷酸翻译为氨基酸序列，对突变前后的 氨基酸序列进行比对，结果表明C1319T未能引起氨基酸的改变，属于同义突变（图2);酶 切位点分析结果表明，C1319T未能产生新的酶切位点或丧失某个酶切位点。
[0044] 第六步：突变位点的分型检测。
[0045] 利用PCR-SSCP技术和错配PCR-RFLP技术对小梅山猪、楓泾猪和大白猪三个猪群 体的PGR基因突变位点C1319T进行分型检测。
[0046] (1) PCR-