一种慢羽公鸡基因型的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因型检测领域，具体而言，涉及一种慢羽公鸡基因型的检测方法。
【背景技术】
[0002] 羽速基因位于鸡的Z染色体上，为伴性基因，控制羽毛生长的速度。快慢羽是一对 等位基因（K-k)，慢羽（K)对快羽（k)为完全显性，公鸡染色体型为ZZ，故慢羽公鸡分纯合 和杂合两种。快慢羽的区分主要由初生雏鸡翅膀上的主翼羽和覆主翼羽的长短来确定，从 而可通过出壳雏鸡的羽型区分性别。但是，纯合慢羽基因型和杂合慢羽基因型的公鸡需要 进一步将未知基因型的慢羽公鸡与慢羽母鸡杂交才得以区分，杂交后纯合慢羽公鸡的后代 全部为慢羽，而杂合慢羽公鸡的后代会出现快羽，且该快羽个体为母鸡。
[0003] 快慢羽自别雌雄是近代养鸡生产中的重要技术措施，已在国内外养鸡业中广泛应 用。但利用表型鉴定鸡的快慢羽在应用于雏鸡自别雌雄时除鉴别准确率因鉴别误差不能达 至IJ 100%外，2010年第32卷第4期China Poultry指出最主要的问题是能进行准确鉴定的 时间有一定的限制，一般不能超过出壳后24h。因此，在培育自别雌雄配套系时一般需从雏 鸡开始，需要2~3个世代才能形成后代达到一定自别雌雄准确率（一般要求99 %以上） 的配套系。
[0004] 为了提高育种效率和鉴定准确率，需要新的检测手段。有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种慢羽公鸡基因型的检测方法，设计了两对引物，对特 定核酸片段进行扩增，并对所扩增出的两个目的片段的DNA进行定量。根据该两个目的片 段的DNA含量比值判断慢羽公鸡的基因型，能快速有效地鉴别出慢羽公鸡的基因型，准确 率高，达到100% ;并且极大程度缩短了建立鸡纯慢羽系的时间。
[0006] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0007] -种慢羽公鸡基因型的检测方法，以纯合慢羽公鸡和杂合慢羽公鸡中含有的特定 片段重复数的不同来判断是否为纯合慢羽公鸡；
[0008] 所述特定片段可通过第一对引物进行PCR扩增；
[0009] 所述第一对引物的上下游引物核酸序列如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。
[0010] Elferink等发现控制羽速的慢羽K等位基因是由串联重复序列构成，其总长度为 176, 324bp，由两个基因部分重复所引起：PRLR基因和编码精子鞭毛蛋白的SPEF2基因，包 含了 PRLR基因的外显子1-11和558bp的外显子12以及SPEF2基因的外显子1-外显子 5。通过设计引物，在慢羽鸡中扩增出一段长78bp的断点连接序列，快羽鸡扩增不出该段序 列，因此，该引物可作为区分快慢羽的一种分子检测手段。在此基础上，通过设计引物扩增 出一段包含78bp的长度为1305bp的断点连接序列，只有慢羽鸡能扩增出来，快羽鸡扩增不 出该段序列。因为公鸡基因型为ZZ，而位于Z染色体上的慢羽K基因有部分片段重复，所以 在DNA初始浓度一致的情况下，理论上通过一定循环数的PCR扩增，纯合慢羽公鸡的该片段 的DNA含量是杂合慢羽鸡该片段DNA含量的2倍，由此鉴定慢羽公鸡的基因型。
[0011] 特定片段重复数的不同可以通过待检测样本与已知纯合慢羽公鸡或已知杂合慢 羽公鸡进行比较来判断；也可以与其自身的内参基因进行比较来判断。
[0012] 优选地，所述特定片段重复数的不同通过内参基因进行比较来判断；
[0013] 所述内参基因可通过第二对引物进行PCR扩增，所述第二对引物的上下游引物核 酸序列如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示。
[0014] 该内参基因GHR位于Z染色体上，与PRLR基因相邻并位于其下游，因为该基因扩 增效率较稳定，故通过GHR内参基因片段的扩增可以消除待检测样本的DNA初始浓度误差； 并且，通过将第一对引物扩增产物的亮度与第二对引物扩增产物的亮度进行对比，可鉴定 慢羽公鸡的基因型。
[0015] 其中，第一对引物进行PCR扩增的目的基因片段长度1305bp;第二对引物进行PCR 扩增的目的基因片段长度857bp。
[0016] 将所述特定片段重复数的不同通过与内参基因进行比较的同时，再与已知基因型 的纯合慢羽或杂合慢羽公鸡的PCR扩增结果进行比较，达到更好的准确度。
[0017] 进一步地，所述特定片段重复数的不同通过与内参基因进行比较采用以下步骤进 行：
[0018] 具有相同基因组DNA含量的待检测样本分别采用第一对引物和第二对引物进行 半定量PCR扩增，得到第一扩增产物和第二扩增产物；
[0019] 分别测定第一扩增产物的目的基因片段的DNA量和第二扩增产物的目的基因片 段的DNA量，并将两者进行比较，判断待检测样本慢羽公鸡的基因型。
[0020] 进一步地，所述比较两者目的基因片段的量，判断待检测样本慢羽公鸡的基因型 具体为：
[0021] 将所述测得第二扩增产物的目的基因片段的DNA量与所述测得第一扩增产物的 目的基因片段的DNA量相除，得到的比值判断待检测样本慢羽公鸡的基因型；
[0022] 所述比值小于1. 35,则待检测样本为纯合慢羽公鸡；
[0023] 所述比值大于1. 85,则待检测样本为杂合慢羽公鸡；
[0024] 优选地，所述比值为1. 05-1. 31，则待检测样本为纯合慢羽公鸡；
[0025] 所述比值为1. 87-2. 51，则待检测样本为杂合慢羽公鸡。
[0026] 由于不同品种间的差异，PCR扩增时两对引物的扩增效率存在差异，判断标准在一 个范围内有波动，但是不影响对结果的判断。
[0027] 基因片段的DNA量采用灰度值分析方法测定，以此鉴定慢羽公鸡的基因型，因为 电泳图可直观观察到纯合和杂合慢羽公鸡之间的不同，故可结合电泳图判断。
[0028] 为了提高鉴定的准确度和具有很好的灵敏度，优选地，所述待检测样本中的基因 组DNA在半定量PCR扩增体系中的浓度为5-15ng/ y 1，所述半定量PCR扩增的循环数为 20-25。如：待检测样本中的基因组DNA在半定量PCR扩增体系中的浓度为5ng/yl，半定 量PCR扩增的循环数为25 ;待检测样本中的基因组DNA在半定量PCR扩增体系中的浓度为 15ng/ y 1，半定量PCR扩增的循环数为20 ;待检测样本中的基因组DNA在半定量PCR扩增 体系中的浓度为l〇ng/ y 1，半定量PCR扩增的循环数为23等等。
[0029] 为了进一步缩小由于待检测样本中的模板DNA含量不同而造成的误差，进一步 地，所述第一对引物和所述第二对引物进行半定量PCR扩增在同一 PCR扩增体系中进行。
[0030] 经多次试验，优选地，所述半定量PCR扩增的反应体系中含有：第一对引物的 上下游引物各〇. 5yl，第二对引物的上下游引物各0. 5yl，2XES Mix 5yl，DNA模板 100ng±5ng，ddH20 补平至 10 y 1 ;
[0031] 其中，所述第一对引物的上下游引物和所述第二对引物的上下游引物的浓度均为 10 yM〇
[0032] 半定量PCR扩增的反应体系中的各组分由于取样时存在误差，误差范围为5%以 内，均在本发明的保护范围内。
[0033] 该体系中的各物质的含量根据体系的扩大或者缩小进行相应的倍增或倍减即可。
[0034] 本发明涉及同一体系或配比中各组分的量，应视为对相关各组分之间比例关系的 限定，而不是对各自用量绝对值的限定。
[0035] 进一步地，所述半定量PCR的反应程序为：
[0036]
[0037] 半定量PCR的反应程序根据一些PCR试剂的要求会有一些差别，对于本领域技术 人员能够预期效果的范围均在本发明的保护范围内。
[0038] 优选地，所述第一扩增产物的目的基因含量和所述第二扩增产物的目的基因含量 通过以下方法检测：
[0039] 取等量（通常2.5yl即可）扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳分离后，利用ImageJ 软件中的灰度值分析方法分析琼脂糖凝胶下的电泳条带的DNA含量。
[0040] 优选地，所述琼脂糖凝胶的质量浓度为1. 0% -1. 2%，电泳电压采用130-150V，电 泳时间为20-25分钟。
[0041] 进一步地，所述待检测样本的基因组DNA的A260/280在1. 8-1. 9之间，A260/230 在1. 6-2. 4之间。
[0042] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0043] (1)本发明提供的一种慢羽公鸡基因型的检测方法，根据不同基因型的慢羽公鸡 含有的特定片段重复数不同建立起来的慢羽公鸡基因型的鉴定方法，鉴定的慢羽公鸡基因 型准确率为100%。
[0044] (2)本发明提供的一种慢羽公鸡基因型的检测方法，只需要用两对引物的一个 PCR扩增体系即可鉴定鸡的快慢羽类型，快速，方便，成本低。
[0045] (3)本发明提供的一种慢羽公鸡基因型的检测方法，可成功鉴别慢羽公鸡中的杂 合个体，减小因为慢羽公鸡杂合导致的鉴别效率低的问题，提高了公鸡的使用价值，并且该 方法只需一个PCR反应即可完成，成本低，效率高，节约时间。
[0046] (4)本发明提供的一种慢羽公鸡基因型的检测方法，可极大程度缩短根据世代淘 汰杂合慢羽公鸡选出纯合慢羽个体建立纯慢羽系的时间，节省了培育成本。
[0047] (5)本发明还对PCR反应体系、循环数、模板DNA的含量等等做出了限制，以增加鉴 定的灵敏性和准确性。
【附图说明】
[0048] 为