一种以流感病毒为载体的hcv核酸检测用质控品及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于HCV核酸检测领域，特别涉及一种以流感病毒为载体的HCV核酸检测 用质控品及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 丙型肝炎病毒（h印atitis C virus，HCV)是一种经血液传播的RNA病毒，可以引 发各种慢性肝病，其中包括肝硬化和肝细胞癌。据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约 为3%，估计约1. 7亿人患有慢性丙肝，每年新发丙型肝炎病例约3. 5万例。我国是HCV慢 性感染率高发国家之一，约有3800万HCV感染者。HCV慢性感染导致肝脏发生慢性炎症坏 死和纤维化，部分患者可能发展成肝硬化乃至肝癌，可严重影响生命健康。因此，对其进行 快速、准确、有效的检测至关重要。
[0003] 实时荧光定量RT-PCR因其灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确与高通量等 优点，已逐步成为HCV检测的一线方法，广泛用于疾病的早期诊断、病情估计、指导用药和 疗效监测中。
[0004] 实时荧光定量RT-PCR包括样本核酸提取、RNA逆转录为cDNA、cDNA扩增和产物分 析四个步骤，检测过程较为复杂，容易受到多种因素的影响。这些因素可能源自于样本自 身，如标本中血红素、肝素、尿素等干扰物质会对PCR反应产生抑制作用。也可来源于人为 因素，如实验人员操作失误造成样本核酸抽提质量不佳或者核酸丢失，可导致靶值偏低乃 至假阴性结果。另外，保存、运输环境中RNA酶和温度等因素引起的病毒核酸降解也不容忽 视。因此，核酸扩增实验中必须采用严格的质量控制措施，需要特定的阳性质控品防止假阴 性结果，这对于保证核酸检测结果的准确、可靠具有重要的意义。
[0005] 目前HCV核酸检测用质控品主要有以下几种：裸露的RNA、阳性病人血清或血浆、 人工制备的假病毒颗粒。裸露的RNA由cDNA经体外转录得到，极易被环境中的核糖核酸酶 (RNase)所降解而难于长期保存，且其不参与核酸抽提过程，因而不能反映病毒的提取效 率。阳性病人血清或血浆相对稳定，可对标本核酸提取及反转录过程进行监测，但因其有潜 在生物安全性、样本来源有限等问题限制了其在临床检测中的应用。为此，相关政府职能部 门鼓励生产厂家研发人工合成质控品以替代上述质控品。
[0006] 近些年来国内外学者进行了大量探索，当前最具代表性的就是Armored RNA技术 制备的假病毒颗粒。它利用MS2噬菌体衣壳蛋白自我组装的特性，采用原核表达技术将特 定病毒RNA包装到MS2噬菌体衣壳蛋白内得到带有检测靶标的噬菌体样颗粒。噬菌体颗 粒RNA由衣壳蛋白保护，能够抵抗核酸酶及各种理化环境因素，具有稳定性好、无生物传染 隐患、可全程监测核酸检测过程等特点，因而解决了传统HCV RNA质控品自身存在的一些问 题。目前已有研究机构利用此技术平台人工合成能模拟临床标本的HCV质控品，在HCV临 床分子诊断中展示了较好的应用前景。
[0007] 然而，Armored RNA技术生产的噬菌体病毒颗粒在实际应用中仍存在一些不足。 首先，在国外Armored RNA技术因专利保护问题导致商品化质控品价格昂贵（http:// asuragen. com/)，非普通临床检验实验室所能承担，这大大限制该产品的临床应用。而在 国内，因缺失相应的产品标准和质量管理规范，目前尚未有Armored RNA技术制备的商品 化HCV质控品，仅有部分机构自行制备，质控品质量不能得到有效保证。其次，对于有包膜 RNA病毒，如HCV，其包膜为脂质双分子层，与噬菌体颗粒表面坚固的衣壳蛋白结构不同，使 用衣壳蛋白噬菌体不能准确反映样本处理检测过程中的变化，因而不能简单地使用衣壳病 毒噬菌体作为此类病毒检测中的质控品。因此，理想质控品的制备应需符合相应质量管理 标准，还应与检测对象具有相同的生物学特性，这对于确保HCV核酸检测的可信性具有重 要意义。
[0008] 病毒学研究近些年获得了巨大发展，如流感病毒反向遗传学技术。特别是 Hoffmann等建立的8质粒反向遗传操作系统，利用同一质粒模板同时生成流感病毒的vRNA 和mRNA，共转染293T细胞后可成功拯救得到流感病毒。相比之前拯救系统，8质粒系统大 大减少了质粒的使用数量，从而显著提高了病毒拯救效率。该技术使得人们可以对病毒基 因直接进行修饰，按预期计划获得目标重配病毒，目前已广泛用于病毒基因组结构与功能、 病毒的转录表达和致病机制研究，侯选疫苗毒株的研制等方面。
[0009] 当前，已有大量关于流感病毒作为外源基因载体用于基因治疗和传染病防控等方 面的报道，如流感嵌合副流感、衣原体、结核杆菌、呼吸道合胞病毒、艾滋病毒和肿瘤等。但 目前国内外尚无流感病毒作为载体用于质控品方面的报道。因此，利用流感反向遗传技术 拯救含有HCV保守目的基因的突变流感病毒，然后参考流感疫苗生产过程制备HCV质控品 将是核酸检测用质控品研究领域新的里程碑。从病毒检测诊断角度看，流感病毒自身即是 脂质双分子层包裹内部核酸，它真实反映了 HCV的结构特性，比外裹衣壳蛋白的噬菌体更 能反映HCV及其在样本中的真实情况。同时，质控品的制备模拟流感疫苗的生产及其质量 控制要求，这些均有相应的国家标准（参见中国药典中"流感全病毒灭活疫苗"相关内容）。 因此，流感病毒为载体的HCV质控品可以最大程度模拟真实病毒核酸检测过程，包括同样 的特异性和灵敏度，真正实现对HCV核酸检测的全方位监测，对于保证HCV RNA检测结果的 准确可靠具有重要的实际应用价值。
【发明内容】
[0010] 本发明所要解决的技术问题是提供一种以流感病毒为载体的HCV核酸检测用质 控品及其制备方法，该质控品可真实模拟HCV病原体，实现对HCV检测的全方位监测；易于 大规模制备，降低成本，稳定性好，易于保存和运输，具有良好的应用前景。
[0011] 本发明的一种以流感病毒为载体的HCV核酸检测用质控品，所述质控品由携带 HCV保守基因的重组流感病毒经扩大培养灭活纯化而得。携带HCV基因的重组流感病毒能 通过病毒拯救方法在细胞内进行拯救，并能在鸡胚中大量扩增。
[0012] 所述流感病毒载体为（A/Puerto Rico/8/34)PR8病毒，也可以是其他亚型流感病 毒骨架。
[0013] 所述HCV保守基因插入的基因片段为PR8病毒基因组的NS基因（编码流感病毒 NS1和NEP蛋白的RNA片段8,序列信息详见GeneBank，序列号：AF389122)。
[0014] 所述HCV保守基因为HCV 5' UTR，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示（序列信息 详见 GeneBank，序列号：AF176573)〇
[0015] 所述携带HCV保守基因的重组流感病毒的NS基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 示。自5'到3'端序列依次为：PR8病毒NS基因的5'非编码区，NS1蛋白编码区（缺失NS1 终止密码子），GSG linker序列，HCV 5'UTR的反向互补序列，GSG linker序列，猪捷申病 毒（porcine teschovirus - 1，PTV-1)的2A肽序列，NEP蛋白编码区，PR8病毒NS基因的 3'非编码区。
[0016] 本发明的一种以流感病毒为载体的HCV核酸检测用质控品的制备方法，包括：
[0017] (1)构建用于流感病毒拯救的在PR8病毒NS基因上插入HCV保守基因的质粒；
[0018](2)将上述构建好的质粒，与分别转录表达PR8病毒PB2 (AF389115)、 PB1 (AF389116)、PA(AF389117)、HA(AF389118)、NP(AF389119)、NA(AF389120)、M(AF389121) 的质粒共转染293T细胞，拯救获得携带HCV 5' UTR的重组流感病毒；
[0019] (3)将上述重组流感病毒进行扩大培养、灭活、纯化，制备成HCV核酸检测用质控 品（参照中国药典中"流感全病毒灭活疫苗"相关内容）。
[0020] 有益效果
[0021] (1)易于大规模制备，降低成本。因重组流感病毒在鸡胚中生长良好，参照流感全 病毒灭活疫苗生产工艺，2~3天即可获得高浓度病毒粒子，从而实现批量生产供应，显著 降低质控品成本。
[0022] (2)稳定性好，易于保存和运输。由于基因组RNA包裹在流感病毒包膜蛋白内，因 而具有耐RNase的特点，可避免被外界环境中RNase降解。室温条件下可保存一个月，4°C 可保存至少8个月，作为质控品具有良好的稳定性。
[0023] (3)无生物传染性，安全可靠。质控品成品经甲醛灭活，在鸡胚中经灭活验证无传 染性，不会对环境造成污染，也不会对临床实验室人员造成危害。
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