用于与抗体药物偶联物疗法一起使用的免疫成像剂的制作方法
【专利说明】用于与抗体药物偶联物疗法一起使用的免疫成像剂 发明领域
[0001] 本发明涉及伴随诊断性抗体样结合蛋白和使用方法。
[0002] 发明背景
[0003] 患者人群中用于治疗用途的药物开发存在很多挑战。多种初始作用剂由于多种原 因不能到达市场（例如临床益处的缺乏或患者群体中经过验证的安全性的缺乏）。对于开 发有效和安全的药物而言的一些关键问题是：（1)在患者群体中确立药物与其目的分子靶 相互作用；（2)在相同患者群体中确立该特异性靶与治疗特定疾病相关；和（3)在相同的患 者群体中基于药物对所述靶的作用鉴定生物学最佳剂量。对于特定药物的合适的伴随诊断 剂的开发在对用于临床患者群体中使用的药物的开发中帮助显著。
[0004] 与分子成像親合（couple)的伴随诊断剂提供了一种对分子祀及其在体内与药 物分子的相互作用有力的、非侵入性的4维评估。一些成像平台的实例包括：磁共振成像 (MRI);正电子发射断层扫描（PET);单光子发射断层扫描（SPECT);光学成像、计算机断层 扫描（CT);超声、X-射线或光声成像。成像对比的选择将特定分子探针和固有的组织特性 考虑在内。伴随诊断剂与分子成像的耦合允许对患者中特定药物与其分子靶的相互作用进 行更好的理解，这对鉴定特定药物的潜在响应者具有帮助且有助于理解和判断药物敏感性 和抗性的机制（及其最佳剂量）。
[0005] 发明概述
[0006] 开发了基于人源化单克隆抗体DS6的伴随诊断性抗体样结合蛋白用作诊断工具， 用于通过成像技术如正电子发射断层扫描（PET)生物成像来体内检测和量化肿瘤相关 MUC1-唾酸糖表位CA6。所述抗体样结合蛋白促进患者分级和人源化DS6抗体药物免疫偶 联物huDS6-DM4疗效（由针对肿瘤相关MUC1-唾酸糖表位CA6的人源化单克隆抗体与细胞 毒性类美登素（maytansin〇id)DM4偶联组成）的早期评估。
[0007] 伴随诊断性抗体样结合蛋白可用于鉴别具有高度CA6表达的患者和患者亚群，其 可优先响应于使用靶向具有高度CA6表达的组织（例如肿瘤组织）的药物的治疗，如使用 靶向CA6表位的抗体药物偶联物（ADC)。所述ADC可以是举例来说与细胞毒性剂（如美登 素衍生物如DM1或DM4)或另一作用剂（如国际公开No.W0 2005/009369中所描述）附接 的huDS6分子。伴随诊断性抗体样结合蛋白可在ADC施用前进行施用，例如以判断受试者 是否可能对用ADC的治疗有响应。
[0008] 伴随诊断性抗体样结合蛋白可通过生物成像技术如正电子发射断层扫描（PET) 用于CA6体内检测，并允许较短的暴露时间和快速的成像，如48-24小时内或更短，所述伴 随诊断剂（companiondiagnostic)是具有合适的清除动力学的高度特异性结合剂。
[0009] 如本文公开，本发明提供特异性结合CA6的抗体样结合蛋白，其中所述抗体样结 合蛋白进一步包含螯合剂。抗体样结合蛋白可通过生物成像技术如PET用作针对体内检测 和量化人CA6肿瘤抗原的诊断工具，其中所述抗体样结合蛋白与合适的螯合剂偶联用于与 生物成像示踪物耦合。
[0010] 如本文公开本发明进一步提供特异结合CA6的抗体样结合蛋白，其中所述抗体样 结合蛋白进一步包含螯合剂。所述抗体样结合蛋白可用作表达CA6肿瘤抗原的组织的成像 或检测剂，其中所述抗体样结合蛋白与合适的螯合剂偶联用于与作用剂耦合。
[0011] 如本文公开本发明进一步提供制备DS6抗体样结合蛋白的方法，其包括将来自人 源化DS6抗体的各\和乂"DNA序列以串联排列并通过接头序列隔开。根据下列式[I]和
[11] ，所述DS6\-接头-DS6VJPDS6VH-接头-DS6Vj^J建体在DNA水平融合至人恒定结构 域序列的3'末端：
[0012] Vlj-Lj-V^-Cl[I]
[0013]VH1-L2-VH2-CH1 [II]
[0014] 其中
[0015]Vu是基于DS6的免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0016] \2是基于DS6的免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0017]VH1是基于DS6的免疫球蛋白重链可变结构域；
[0018]VH2是基于DS6的免疫球蛋白重链可变结构域；
[0019]Q是免疫球蛋白轻链恒定结构域，如人IGKC免疫球蛋白轻链恒定结构域；
[0020] CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域，如人免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
[0021] LJPL2是氨基酸接头；且
[0022] 其中所述、和V^多肽可以是相同或不同的基于DS6的免疫球蛋白轻链可变结构 域，且所述VH1和VH2多肽可以是相同或不同的基于DS6的免疫球蛋白重链可变结构域；且 其中式I的多肽和式II的多肽形成二价单特异性串联免疫球蛋白抗体样结合蛋白。Q和 CH1结构域可接合起来，如通过二硫键。此外，式I和式II的多肽可包含任选的标签（例如 多聚组氨酸或6x_His标签）。
[0023] 如本文公开本发明可进一步提供在患者中治疗病症如癌症的方法，其包括以下 步骤：获得患者中CA6的表达水平，其中将特异性地结合CA6且进一步包含螯合剂的抗体 样结合蛋白施用至所述患者，并作出组织是否表达CA6的判断，且如果患者具有相比参照 组织中的CA6表达水平高至少10% (例如比参照组织中CA6的表达水平高10%、20%、 30%、40%或更高）的CA6表达水平，则施用huDS6-DM4至所述患者。在一些实施方案，本 发明中的特征抗体样结合蛋白用于确定肿瘤组织中如衆液性卵巢癌瘤（serousovarian carcinoma)、子宫内膜样卵巢癌瘤（endometriodovariancarcinoma)、子宫颈赞生物 (neoplasmoftheuterinecervix)、子宫内膜赞生物（neoplasmoftheendometrius)、 外阴赘生物（neoplasmofthevulva)、乳腺癌瘤（breastcarcinoma)、胰腺肿瘤 (pancreatictumor)和尿路上皮肿瘤（tumoroftheurothelium)中CA6 的表达水平。
[0024] 如本文公开本发明进一步提供判断癌症患者是否是用huDS6_DM4的治疗的候选 者的方法，所述方法以下步骤：获得患者中CA6的表达水平，其中将特异性地结合CA6且进 一步包含螯合剂的抗体样结合蛋白施用至所述患者，并作出CA6的表达水平相比参照组织 中CA6的表达是否高至少10% (例如比参照组织中CA6的表达高10%、20%、30%、40%或 更高）的判断；且当做出的判断为肯定时提供癌症患者是对于huDS6-DM4的治疗的候选者 的指示。
[0025] 如本文公开本发明进一步提供监测癌症患者对用huDS6_DM4的治疗的响应的方 法，所述方法包括以下步骤：获得患者中的CA6的表达水平，将特异性地结合CA6且进一步 包含螯合剂的抗体样结合蛋白施用至所述患者，用huDS6-DM4治疗前和治疗中，做出CA6的 表达水平是否作为用huDS6-DM4治疗的结果而增加、保持相同或降低的判断；且如果患者 中CA6的表达水平相比用huDS6-DM4治疗前CA6表达的水平已降低，则提供治疗应该继续 的指示。
[0026] 本发明提供特异性地结合CA6的抗体样结合蛋白，其中所述抗体样结合蛋白包含 两条多肽，所述多肽具有由下列式[I]和[II]代表的结构：
[0027]Vlj-Lj-V^-Cl[I]
[0028]VH1-L2-VH2-CH1 [II]
[0029]其中：
[0030] Vu是基于DS6的免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0031] \2是基于DS6的免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0032] VH1是基于DS6的免疫球蛋白重链可变结构域；
[0033] VH2是基于DS6的免疫球蛋白重链可变结构域；
[0034] Q是免疫球蛋白轻链恒定结构域，如人IGKC免疫球蛋白轻链恒定结构域；
[0035] CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域，如人免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
[0036]LJPL2是氨基酸接头；
[0037] 其中所述式I的多肽和式II的多肽形成二价单特异性串联免疫球蛋白抗体样结 合蛋白；且
[0038] 其中所述抗体样蛋白进一步包含螯合剂。
[0039] 本发明还提供制备特异性地结合CA6的抗体样结合蛋白的方法，其中所述抗体样 结合蛋白进一步包含螯合剂，所述方法包括：
[0040] (a)在细胞中表达一种或多种编码多肽的核酸分子，所述多肽具有由下列式[I] 和[II]代表的结构：
[0041]Vlj-Lj-V^-Cl[I]
[0042]VH1-L2-VH2-CH1 [II]
[0043]其中：
[0044]Vu是基于DS6的免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0045] \2是基于DS6的免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0046]VH1是基于DS6的免疫球蛋白重链可变结构域；
[0047]VH2是基于DS6的免疫球蛋白重链可变结构域；
[0048] (^是免疫球蛋白轻链恒定结构域，如人IGKC免疫球蛋白轻链恒定结构域；
[0049]CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域，如人免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
[0050]LJPL2是氨基酸接头；且
[0051] 其中式I的多肽和式II的多肽形成二价单特异性串联免疫球蛋白抗体样结合蛋 白；且
[0052](b)将所述抗体样结合蛋白与所述螯合剂附接。
[0053] 本发明进一步提供在患者中用于治疗表达CA6的疾病组织的方法，其包括：施用 特异性结合CA6且进一步包含螯合剂和成像剂的抗体样结合蛋白至所述患者；在患者中通 过正电子发射断层扫描（PET)成像识别表达CA6的疾病组织；且如果CA6的表达在疾病组 织中大于或等于参照标准中CA6表达的10%，则确定所述患者是使用huDS6-DM4的治疗的 候选者。
[0054] 本发明进一步提供在患者中治疗CA6阳性癌症的方法，其包括步骤：获得关于患 者中CA6的表达水平的信息；且如果患者中CA6的表达水平大于或等于参照标准中CA6表 达的10%，则施用huDS6-DM4至所述患者。
[0055] 本发明进一步提供判断癌症患者是否为使用huDS6_DM4的治疗的候选者的方法， 其包括步骤：获得关于患者中CA6表达水平的信息；且如果患者中CA6的表达水平大于或 等于参照标准中CA6表达的10%，则确定所述患者是使用huDS6-DM4的治疗的候选者。
[0056] 本发明进一步提供监测癌症患者对使用huDS6_DM4的治疗的响应的方法，其包括 步骤：施用huDS6-DM4后获得关于患者中CA6的表达水平的信息；且如果患者中CA6的表达 水平与使用huDS6-DM4治疗前CA6的表达水平相比已降低，则提供所述治疗应继续的指示。
[0057] 本发明提供特异性地结合CA6的抗体样结合蛋白，其中所述抗体样结合蛋白包含 两条多肽，所述多肽具有由下列式[I]和[II]代表的结构：
[0058] Vlj-Lj-V^-Cl [I]
[0059] VH1-L2-VH2-C H1 [II]
[0060] 其中
[0061] Vu是基于DS6的免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0062] \2是基于DS6的免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0063] VH1是基于DS6的免疫球蛋白重链可变结构域；
[0064] VH2是基于DS6的免疫球蛋白重链可变结构域；
[0065] Q是免疫球蛋白轻链恒定结构域，如人IGKC免疫球蛋白轻链恒定结构域；
[0066] CH1是免疫球蛋白C H1重链恒定结构域，如人免疫球蛋白C H1重链恒定结构域；
[0067] LJP L 2是氨基酸接头；且
[0068]其中式I的多肽和式II的多肽形成二价单特异性串联免疫球蛋白抗体样结合蛋 白。
[0069] 本发明还提供用于制备特异性结合CA6的抗体样结合蛋白的方法，其包括在细胞 中表达一种或多种编码多肽的核酸分子，所述多肽具有由下列式[I]和[II]代表的结构：
[0070] Vlj-Lj-V^-Cl [I]
[0071] VH1-L2-VH2-C H1 [II]
[0072]其中：
[0073] Vu是基于DS6的免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0074] \2是基于DS6的免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0075] VH1是基于DS6的免疫球蛋白重链可变结构域；
[0076] VH2是基于DS6的免疫球蛋白重链可变结构域；
[0077] Q是免疫球蛋白轻链恒定结构域，如人IGKC免疫球蛋白轻链恒定结构域；
[0078] CH1是免疫球蛋白C H1重链恒定结构域，如人免疫球蛋白C H1重链恒定结构域；
[0079] LJP L 2是氨基酸接头；且
[0080]其中式I的多肽和式II的多肽形成二价单特异性串联免疫球蛋白抗体样结合蛋 白。
[0081] 本发明的具体实施方案将从下文对一些实施方案的详述和权利要求变得显而易 见。
[0082] 附图简述
[0083] 图1.二价工程化的抗体样结合蛋白、二价单特异性串联免疫球蛋白片段（B-Fab) 的示意图。B-Fab蛋白的实例包括：具有G4SG4S接头（SEQIDN0:3)和C-末端6x-His标 签的B-Fab、具有G4SG4S接头（SEQIDN0:3)而无C-末端6x-His标签的B-Fab和具有G4S 接头和C-末端6x-His标签的B-Fab。
[0084]图2.经由凝胶电泳（图2A)、尺寸排阻色谱（SEC)(图2B)和荧光激活细胞分选 (卩八05)(图2<：和图20)对具有6666566665((645)2)接头（5￡〇10勵:3)和(：-末端61-把8 标签的基于B-FabDS6的工程化抗体的评估。
[0085]图3.经由凝胶电泳（图3A)、SEC(图3B)和FACS(图3C和图3D)对具有（G4S)2 接头的基于B-FabDS6的工程化抗体的评估。
[0086] 图4.经由凝胶电泳（图4A)、SEC(图4B)和FACS(图4C和图4D)对具有 GGGGS(G4S)接头和C-末端6x-His标签的基于B-Fab DS6的工程化抗体的评估。
[0087]图 5?经由FACS使用A2780 细胞无D0TA(图 5A)、WISH细胞无D0TA(图 5B)、WISH 细胞和D0TA(图5C)对基于B-FabDS6的工程化抗体的评估，证明D0TA偶联并不改变DS6 结合。
[0088] 图6.64Cu-D0TA-DS6B-Fab抗体样结合蛋白的评估证明用64Cu的放射性标记和 D0TA偶联允许理想的放射化学（图6A)和血清稳定性（图6B)。
[0089] 图7?具有双抗体支架（图7A)和B-Fab支架（图7B)的抗体样结合蛋白间的比 较。
[0090] 发明详述
[0091] 如本文公开