L-精氨酸生产能力提高的棒状杆菌属微生物以及利用其的l-精氨酸的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及L-精氨酸生产能力提高的重组棒状杆菌属微生物以及利用该微生物 生产L-精氨酸的方法。
【背景技术】
[0002] L-精氨酸以游离状态包含于植物种子或大蒜，其被用作氨基酸类增强剂，也广泛 被利用于药品、食品等。其作为医药用，用于肝功能促进剂、脑功能促进剂、男性不孕治疗 剂、综合氨基酸制剂等，作为食品用，用于生鲜冻（确今i号）添加剂、健康饮料添加剂、高血 压患者的食盐代替用，从而成为最近受到注目的物质。
[0003] 棒状杆菌（Corynebacterium)属微生物通过环形步骤途径实现L-精氨酸的 生物合成，L-精氨酸从L-谷氨酸经由N-乙酰谷氨酸（N-acetylglutamate)、N-乙酰 谷氨酰磷酸（N-acetylglutamylphosphate)、N_ 乙酰谷氨酸半酸（N-acetylglutamate semialdehyde)、N-乙酰鸟氨酸（N-acetylornithine)、鸟氨酸（ornithine)、瓜氨酸 (citrulline)以及精氨琥J白酸（argininosuccinate)而合成。
[0004] 此外，已知谷氨酸棒状杆菌受到细胞内精氨酸的反馈抑制（feedback inhibition)(VeharySakanyanetal，Microbiology，142:9_108，1996)，从而已知在生产 高收率的L-精氨酸方面存在局限。
[0005] 池田等报告了在精氨酸发酵时瓜氨酸蓄积于发酵培养基上（ApplEnviron Microbiol. 2009Mar；75 (6):1635-41.Epub2009Jan9)〇
[0006] 在上述生物合成过程中，瓜氨酸与天冬氨酸（aspartate)结合而成为精氨琥 I白酸，释放富马酸（fumarate)而成为精氨酸。在此，天冬氨酸氨裂解酶（aspartate ammonia-lyase，aspA)是由富马酸和氨合成天冬氨酸的酶（图1)，天冬氨酸氨基转移酶 (aspartateaminotransferase，aspB)是具有通过从天冬氨酸、谷氨酸、氨基丁酸等多种 L-氨基酸将氨基转移到a_酮戊二酸、a_酮异戊酸等酮酸来合成多种L-氨基酸的催化剂 功能的酶。
[0007] Menkel等报告了将大肠杆菌的aspA导入棒状杆菌型微生物时增加天冬氨酸的可 用性，从而增加L-赖氨酸的生产（APPLIEDANDENVIRONMENTALMICR0BI0L0GY，Mar. 1989， p.684-688)。
[0008] 因此，本发明人等确认了，通过使天冬氨酸氨裂解酶和/或天冬氨酸氨基转移酶 的表达增强来增加与瓜氨酸结合的天冬氨酸的流入，能够提供L-精氨酸的生产能力提高 的棒状杆菌属微生物，从而完成本发明。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于，提供L-精氨酸的生产能力提高的棒状杆菌属微生物。
[0010] 本发明的另一目的在于，提供利用上述棒状杆菌属微生物生产L-精氨酸的方法。
[0011] 为了实现上述目的，本发明提供因天冬氨酸氨裂解酶的活性增强而L-精氨酸生 产能力提高的棒状杆菌属微生物。
[0012] 本发明还提供通过培养上述棒状杆菌属微生物生产L-精氨酸的方法。
[0013] 本发明提供因天冬氨酸氨裂解酶活性增强或在此基础上进一步地天冬氨酸氨基 转移酶的活性增强而L-精氨酸生产能力提高的重组棒状杆菌属微生物，上述重组棒状杆 菌属微生物由于能够以高收率生产L-精氨酸，因此可以在工业上有效利用。
【附图说明】
[0014] 图1表示由瓜氨酸合成精氨酸的途径以及由富马酸合成天冬氨酸的途径。
【具体实施方式】
[0015] 下面，详细说明本发明。
[0016] 本发明提供L-精氨酸的生产能力提高的棒状杆菌属微生物。
[0017] 本发明中，上述用语"L-精氨酸生产能力（L-arginineproductivity) "是指，在 培养基中培养本发明的棒状杆菌属微生物时，使L-精氨酸蓄积于培养基的能力。这样的 L-精氨酸生产能力可以是棒状杆菌属微生物的野生型菌株的特性、或者通过人工突变而添 加或增强的特性。
[0018]例如，为了赋予L-精氨酸的生产能力，可以将棒状杆菌属微生物育种成对精氨酸 羟肟酸具有耐性；可以育种成对琥珀酸具有营养要求性或者对核酸碱基(H笔内:)同 系物具有耐性；可以育种成无法使精氨酸进行物质代谢，对精氨酸拮抗剂和刀豆氨酸具有 耐性，且对赖氨酸具有营养要求性；可以育种成对精氨酸、精氨酸羟肟酸、高精氨酸、D-精 氨酸和刀豆氨酸具有耐性，或者对精氨酸羟肟酸和6-氮尿嘧啶具有耐性；可以育种成对刀 豆氨酸具有耐性。
[0019] 此外，通过按照使编码L-精氨酸生物合成酶的基因的表达增强的方式对棒状杆 菌属微生物进行变形，可以赋予L-精氨酸的生产能力。L-精氨酸生物合成酶的例子包括： N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶（argC)、鸟氨酸乙酰转移酶（argj)、N-乙酰谷氨酸激酶（argB)、 乙酰鸟氨酸转氨酶（argD)、鸟氨酸氨基甲酰转移酶（argF)、精氨琥珀酸合成酶（argG)、精 氨琥珀酸裂解酶（argH)和氨基甲酰磷酸合成酶。这些精氨酸生物合成酶存在于Arg操 纵子（argCJBDFRGH)上，由被argR编码的精氨酸阻抑物调节（JBacteriol.2002Dec; 184(23) : 6602-14.)。由此，通过精氨酸阻抑物的弱化（US2002-0045223)、或者使上述生物 合成相关基因中的一个以上基因过表达，可以赋予L-精氨酸生产能力。
[0020] 在本发明中，具有L-精氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物只要具有生产L-精氨 酸的能力就没有特别限制。优选地，可以为能够生产L-精氨酸的谷氨酸棒状杆菌，更优选 地，可以为谷氨酸棒状杆菌KCCM10741 (韩国专利注册号0791659)以及谷氨酸棒状杆菌 ATCC21831。
[0021] 作为用于实现上述目的的一个方案，本发明提供因天冬氨酸氨裂解酶的活性增强 而L-精氨酸生产能力提高的棒状杆菌属微生物。
[0022] 天冬氨酸氨裂解酶（aspartateammonia-lyase，aspA)是由富马酸和氨合成天冬 氨酸的酶，因此可以通过使上述天冬氨酸氨裂解酶的表达增强而增加天冬氨酸的合成，借 助于增加的天冬氨酸而提高L-精氨酸的生产率。
[0023] 在本发明中，上述天冬氨酸氨裂解酶只要是具有上述活性的酶，就可以使用来源 于任何微生物的酶，优选地，可以使用来源于埃希氏菌属微生物或棒状杆菌型微生物的酶， 更优选地，可以使用来源于大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌的酶。具体地说，上述天冬氨酸氨裂 解酶可以具有以序列号21或序列号22记载的氨基酸序列。具有上述序列号21的氨基酸 序列的来源于棒状杆菌属微生物的天冬氨酸氨裂解酶由具有以序列号23记载的碱基序列 的aspA(NCgll446)编码，具有上述序列号22的氨基酸序列的来源于埃希氏菌属微生物的 天冬氨酸氨裂解酶由具有以序列号24记载的碱基序列的aspA(NCBIGENEID: 12933698) 编码。
[0024] 只要是本发明中公开的具有天冬氨酸氨裂解酶的活性的蛋白质，则相对于上 述蛋白质的氨基酸序列具有80%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上、特别优选 为97%以上的同源性的天冬氨酸氨裂解酶也包含于本发明。相对于上述氨基酸序列 的同源性例如可以使用根据文献的算法BLAST[参考：Karlin和Altschul，Pro.Natl. Acad.Sci.USA, 90,5873(l"3)]或利用皮尔逊（Pearson)的FASTA[参考：Methods Enzymol.，183,63(1990)]来确定。基于这样的算法BLAST，开发出被称为BLASTN或BLASTX 的程序[参考：http://www.ncbi.nlm.nih.gov] 〇
[0025] 作为用于实现上述目的的另一个方案，本发明提供进一步地天冬氨酸氨基转移酶 的活性增强的棒状杆菌属微生物。