一种从桑白皮生物总碱中分离微量生物碱单体的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及从桑白皮总生物碱中提取分离出荞麦碱、1，4-dideoxy-l, 4-1mino-d-arabinitol、l-脱氧野尻霉素等几种生物碱活性单体的技术方法和技术要点。
【背景技术】
[0002]目前市场上用于治疗糖尿病的药物主要为磺脲类、双胍类和α-糖苷酶抑制剂。但磺脲类药物容易引起持久性的低血糖症，双胍类则会产生严重的胃肠道反应和肝肾损伤，而α -糖苷酶抑制剂除腹内气体增加外，其他不良反应较少，已经被广泛用来降低餐后高血糖。目前临床上用于治疗糖尿病的α-糖苷酶抑制剂药物有拜糖苹，倍欣和国产品中药中的桑白皮及有关药物。国内降糖中成药主要以复方或单方中药制成，虽兼顾预防糖尿病并发症，但其降糖效果一般较缓慢，且服药剂量大，状况亟待改善。
[0003]桑白皮为桑科植物桑Morus alba L.的干燥根皮，中医理论认为桑白皮具泻肺平喘，利水消肿之功效。现代药理学研究表明桑白皮中主要含有1-脱氧野尻霉素(DNJ)、荞麦碱、1，4-dideoxy-l, 4-1mino-d_arabinitol、甜菜碱等多种生物碱类成分，其中1-脱氧野尻霉素(DNJ)、荞麦碱等均是作用明确的α-葡萄糖苷酶的抑制活性物质，其它生物碱亦具有辅助降糖作用。现代药理研究证明桑白皮可以抑制血糖升高，预防和治疗糖尿病。目前对桑白皮总碱特别是1-脱氧野尻霉素(DNJ)降糖研究的报道越来越多，但投入生产的桑白皮总碱降糖药却鲜有。
[0004]本发明的主要目的是提供一种在提取桑白皮生物总碱物的基础上分离出总碱中几种重要活性单体的方法。将分离出的单体用于桑白皮总碱质量标准的定位对照品，指导降糖药桑白皮生物总碱以更快的速度、更好的质量上市及其他用途。
【发明内容】
[0005]本发明公开了以粗提取的桑白皮生物总碱为原材料，分离出总碱中几种具有降糖作用生物碱单体的方法。
[0006]为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是:
[0007]本发明使用的桑白皮生物总碱原材料是参照专利“一种桑白皮总生物碱提取物及其制备应用”(CN103381200A)的方法自提的产品。以自提总碱为初始物，经甲醇复溶除去总碱粗品中的大部分1-脱氧野尻霉素(DNJ)，将洗脱液浓缩后进行衍生化反应，再过硅胶柱柱层析，通过柱洗脱得到几种活性生物碱单体的衍生物，最后再将衍生化基团解离掉，得到生物碱单体。所得单体含量均在99.5%以上。
[0008]上述制备各单体的步骤为:
[0009](I)、衍生化反应:
[0010]取桑白皮总碱粗提品适量，以1-20倍量甲醇溶解，抽滤液减压浓缩至干，加入4-8倍量(桑白皮生物总碱粗体物)溶剂溶解，缓慢加入0.5-5倍量衍生化试剂，搅拌反应2h以上，加入5-20倍量水稀释，依次以石油醚萃取、用环己烷萃取、弃去有机层，水层再用乙酸乙酯萃取、减压回收有机溶剂得衍生化物，备用。
[0011](2)、过柱分离:
[0012]取上述衍生化物一一上100?200目硅胶柱一一用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱(薄层跟踪检测，收集目标单点流出液)一一减压回收溶剂，得单体衍生物。
[0013](3)、单体衍生物的解离:
[0014]取上述各单体衍生物适量一一加0.5-5倍量甲醇使溶解一一加0.1-1.0有机碱，脱去衍生化试剂、减压回收溶剂经重结晶或柱分离得到单体。
[0015]上述衍生化反应中的溶剂为水、无机碱性水溶液、无机碱性缓冲液、二氧六环、四氢呋喃中的一种或两种以上等，优选为pH9.0的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液与四氢呋喃(1:1)的混合溶液。
[0016]上述衍生化反应中的衍生化试剂为苄氧羰基化物、叔丁氧羰基化物、9-芴甲氧基碳基化物中等胺基保护试剂，优选为9-芴甲氧基碳基化物中的9-芴甲氧基酰氯(Fmol-Cl) ο
[0017]上述在单体衍生物的解离中的有机碱为三乙胺、二乙胺、氨水中的一种或几种，优选为三乙胺。
[0018]本法制备单体过程的衍生化步骤中，甲醇的用量、衍生化试剂的量及衍生化时间不仅对产品收率有影响，还会影响所得单体的纯度.当使用10倍量甲醇、3倍量衍生化试剂及衍生化时间10小时时，所得各单体较纯，纯度均在99.5%以上。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施+例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0020]实施例1桑白皮生物碱单体的制备
[0021](I)、衍生化反应:
[0022]取桑白皮总碱粗提品适量，以10倍量甲醇溶解，抽滤液减压浓缩至干，加入6倍量(桑白皮生物总碱粗体物)PH9.0的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液与四氢呋喃1:1混合溶液溶解，缓慢加入3倍量9-芴甲氧基酰氯(Fmol-Cl)试剂，搅拌反应10h，加入5倍量水稀释，依次以石油醚萃取、用环己烷萃取、弃去有机层，水层再用乙酸乙酯萃取、减压回收有机溶剂得衍生化物，备用。
[0023](2)、过柱分离:
[0024]取上述衍生化物一一上100?200目硅胶柱一一用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱(薄层跟踪检测，收集目标单点流出液)一一减压回收溶剂，得单体衍生物。
[0025](3)、单体衍生物的解离:
[0026]取上述各单体衍生物适量——加3倍量甲醇使溶解——加0.5倍量三乙胺，脱去衍生化试剂、减压回收溶剂经重结晶或柱分离得到单体。
[0027]几种生物碱单体按极性从大到小的顺序排列并用质谱检测纯度，依次为:
[0028]荞麦碱:纯度为99.7%
[0029]1-脱氧野尻霉素:纯度为99.8%
[0030]五元环油状物:纯度为99.6%
[0031]I, 4-dideoxy-l, 4-1mino-d-arabinitol:纯度为 99.6%
[0032]实施例2桑白皮生物碱单体的制备
[0033](I)、衍生化反应:
[0034]取桑白皮总碱粗提品适量，以I倍量甲醇溶解，抽滤液减压浓缩至干，加入4倍量(桑白皮生物总碱粗体物)PH9.0的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液与四氢呋喃1:1混合溶液溶解，缓慢加入0.5倍量9-芴甲氧基酰氯(Fmol-Cl)，搅拌反应2h，加入10倍量水稀释，依次以石油醚萃取、用环己烷萃取、弃去有机层，水层再用乙酸乙酯萃取、减压回收有机溶剂得衍生化物，备用。
[0035](2)、过柱分离:
[0036]取上述衍生化物一一上100?200目硅胶柱一一用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱(薄层跟踪检测，收集目标单点流出液)一一减压回收溶剂，得单体衍生物。
[0037](3)、单体衍生物的解离:
[0038]取上述各单体衍生物适量一一加0.5倍量甲醇使溶解一一加0.1倍量三乙胺，脱去衍生化试剂、减压回收溶剂经重结晶或柱分离得到单体。
[0039]几种生物碱单体按极性从大到小的顺序排列并用质谱检测纯度，依次为:
[0040]荞麦碱:纯度为95.5%
[0041 ] 1-脱氧野尻霉素:纯度为96.2%
[0042]五元环油状物:纯度为98.5%
[0043]I, 4-dideoxy-l, 4-1mino-d-arabinitol:纯度为 97.8%
[0044]实施例3桑白皮生物碱单体的制备
[0045](I)、衍生化反应:
[0046]取桑白皮总碱粗提品适量，以20倍量甲醇溶解，抽滤液减压浓缩至干，加入8倍量(桑白皮生物总碱粗体物)PH9.0的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液与四氢呋喃1:1混合溶液溶解，缓慢加入5倍量9-芴甲氧基酰氯(Fmol-Cl)，搅拌反应2h，加入20倍量水稀释，依次以石油醚萃取、用环己烷萃取、弃去有机层，水层再用乙酸乙酯萃取、减压回收有机溶剂得衍生化物，备用。
[0047](2)、过柱分离:
[0048]取上述衍生化物一一上100?200目硅胶柱一一用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱(薄层跟踪检测，收集目标单点流出液)一一减压回收溶剂，得单体衍生物。
[0049](3)、单体衍生物的解离:
[0050]取上述各单体衍生物适量一一加5倍量甲醇使溶解一一加I倍量三乙胺，脱去衍生化试剂、减压回收溶剂经重结晶或柱分离得到单体。
[0051]几种生物碱单体按极性从大到小的顺序排列并用质谱检测纯度，依次为:
[0052]荞麦碱:纯度为99.6%
[0053]1-脱氧野尻霉素:纯度为99.7%
[0054]五元环油状物:纯度为99.7%
[0055]I, 4-dideoxy-l, 4-1mino-d-arabinitol:纯度为 99.5%
[0056]实施例4桑白皮生物碱单体的制备
[0057](I)、衍生化反应:
[0058]取桑白皮总碱粗提品适量，以20倍量甲醇溶解，抽滤液减压浓缩至干，加入8倍量(桑白皮生物总碱粗体物)水溶解，缓慢加入5倍量9-芴甲氧基酰氯(Fmol-Cl)，搅拌反应2h，加入20倍量水稀释，依次以石油醚萃取、用环己烷萃取、弃去有机层，水层再用乙酸乙酯萃取、减压回收有机溶剂得衍生化物，备用。
[0059](2)、过柱分离:
[0060]取上述衍生化物一一上100?200目硅胶柱一一用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱(薄层跟踪检测，收集目标单点流出液)一一减压回收溶剂，得单体衍生物。
[0061 ] (3)、单体衍生物的解离:
[0062]取上述各单体衍生物适量一一加5倍量甲醇使溶解一一加I倍量三乙胺，脱去衍生化试剂、减压回收溶剂经重结晶或柱分离得到单体。
[0063]几种生物碱单体按极性从大到小的顺序排列并用质谱检测纯度，依次为:
[0064]荞麦碱:纯度为95.4%
[0065]1-脱氧野尻霉素:纯度为95.2%
[0066]五元环油状物:纯度为95.7%
[0067]I, 4-dideoxy-l, 4-1mino-d-arabinitol:纯度为 96.5%
[0068]实施例5桑白皮生物碱单体的制备
[0069](I)、衍生化反应:
[0070]取桑白皮总碱粗提品适量，以20倍量甲醇溶解，抽滤液减压浓缩至干，加入8倍量(桑白皮生物总碱粗体物)PH9.0的碳酸钠-碳酸