一种黄酮类化合物及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种黄酮类化合物及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 全缘叶绿绒蒿 Meconopsis integrifolia(Maxim. )Franch.为罂粟科 (Papaveraceae)绿绒蒿属（Meconopsis)植物，为传统藏药材，在我国主要分布于西藏、四 川、云南、青海、甘肃等省区。《晶珠本草》记载全缘叶绿绒蒿以花入药，用于治疗肝炎、肺炎 和水肿 [12]。现代化学成分研究对全缘叶绿绒蒿的地上部分的化学成分进行了较系统的研 究，采用传统分离方法分离得到了生物碱和黄酮等化合物 [3 5]。而藏医药书籍记载全缘叶绿 绒蒿以花入药，未发现有文献报道对全缘叶绿绒蒿花的化学成分进行研究。并且，绿绒蒿属 植物的化学成分多采用硅胶柱色谱、中压柱层析、制备液相、Sephadex LH-20等传统分离方 法进行分离[3 7]，因此，简单、快速、重复性好的分离制备纯化合物的方法在该属植物中将会 受到越来越多的关注。
[0003] 高速逆流色谱（High-speed counter-current chromatography, HSCCC)技术依据 化合物在互不相溶的两相溶剂中的分配系数的差异而实现分离。不需要固体载体，可避免 样品在分离过程中的不可逆吸附和分解，溶剂系统的极性可根据化合物的性质选择，选择 范围广，适合各种极性的化合物，并且分析时间较短，回收率和产品纯度高，适宜放大，便于 工业化生产，可有效用于分离制备天然产物 [s 1(：]。
[0004] Zhou等[11]报道，全缘叶绿绒蒿地上部分70 %乙醇提取物有较好的肝保护作用，因 此本发明通过HSCCC法，首次对全缘叶绿绒蒿花70%乙醇提取物的主要化学成分进行分离 研究。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种新的黄酮类化合物。本发明的另一目的在于提供该化 合物的制备方法和用途。
[0006] 本发明提供了如式4所示黄酮类化合物：
[0007]
[0008]式 4。
[0009] 本发明还提供了式4化合物的制备方法，它包括如下操作步骤：
[0010] (1)粗提物的制备：
[0011] 取罂粟科绿绒蒿属植物全缘叶绿绒蒿M. integrifolia(Maxim. )Franch.的花，粉 碎，以60~70% v/v乙醇为溶剂进行提取，收集醇提液，减压回收乙醇，依次用水-乙酸乙 酯溶剂系统和水-正丁醇溶剂系统萃取，合并乙酸乙酯和正丁醇萃取液，除去溶剂后，所得 残渣即为粗提物；
[0012] (2)高速逆流色谱分离：
[0013] 取乙酸乙酯：正丁醇：水=2 :3 :5v/v/v，充分振摇，静置分层，以上相为固定相，下 相为流动相，将固定相充满分离螺旋管，柱温30~35°C，主机正转，转速为890~920r/ min，然后以2mL/min的流速栗入流动相，至两相溶剂在管柱中达到平衡状态；将步骤（1)制 备的粗提物，以下相为溶剂溶解，制备样品溶液，将样品溶液进样，在254nm下监测，收集出 峰时间为420~450min的目标成分，即得式4化合物。
[0014] 溶剂体系的选择是高速逆流色谱分离（HSCCC)中至关重要的环节，需根据待分离 物质的理化性质，选择合适的溶剂体系。分配系数是HSCCC分离的一个重要参数，是筛选溶 剂体系的参考依据之一，理想的分配系数为〇. 5~2, K值太大使谱带增宽，K值太小则峰无 法分离[12 13]。本发明采用UPLC法测定溶剂体系的K值，结果见表1。
[0015] 表1化合物1~4在不同溶剂系统中的K值
[0016]
[0017] 从表1可以看出，氯仿/甲醇/水体系（4:3:2)中目标化合物的K值太大，不适合 分离，故尝试选择乙酸乙酯/正丁醇/水体系。结果表明，不同体积溶剂配比中，乙酸乙酯 / 正丁醇 / 甲醇 / 水体系（4:1:0.5:5, v/v/v/v)尽管 K 值（1.K = 0.58 ;2.K = 0.82 ;3.K =1. 38 ;4.K = 1. 26)合适，但实际分离中目标峰的分离效果并不好，峰未分开，四个峰被 一起冲出。故考虑通过增大K值的方式使出峰时间延缓，试验是否能使峰达到分离的目的。 减少乙酸乙酯的体积，增大正丁醇的体积，当采用溶剂体系为乙酸乙酯/正丁醇/水体系 (3:2:5, v/v/v)时，K值较大，峰3和4的K值已大于2,分离效果有所改善，但峰仍不能达 到分离。继续减少乙酸乙酯，增大正丁醇的量，采用乙酸乙酯/正丁醇/水体系（2:3:5，v/ v/v)，尽管 K 值已经很大（1. K = 1. 85 ;2. K = 2. 46 ;3. K = 4. 45 ;4. K = 4. 56)，远大于 2， 但仍能得到较好的分离效果。由此可认为，分离本发明各化合物选择溶剂体系时，除了参考 K值外，实际的分离试验也很有必要，采用K值较大的溶剂体系，延缓出峰时间，有利于峰的 分呙。
[0018] HSCCC分离的其他条件如转速、柱温、流速对分离也有较大的影响，需进行试验选 择合适的条件。乙酸乙酯/正丁醇/水体系属于界面张力较高的溶剂系统，较高的转速可 以促进分配和减少质点的传递阻力 [14]，故选择转速为900r/min。仪器柱温对固定相的保 留有不可忽视的作用，对亲水性强的正丁醇溶剂体系的固定相保留率有较大影响，升高柱 温有助于提高该体系的固定相保留率[15]，试验发现，当柱温35°C时，乙酸乙酯/正丁醇/水 (2 :3:5，v/v/v)体系的保留率为46%，达到分离要求。由于所选溶剂体系保留率较低，高流 速不利于固定相保留，故选择流速为2. OmL/min。
[0019] 进一步地，步骤（1)中，乙醇浓度为70% v/v。
[0020] 进一步地，步骤（2)中，检测波长为254nm〇
[0021] 本发明还提供了式4化合物在制备抗氧化的药品或保健品中的用途。
[0022] 进一步地，所述药品或保健品是清除自由基的药品或保健品。
[0023] 其中，所述自由基为DPPH自由基。
[0024] 本发明还提供了一种药物或保健品组合物，它是以式4化合物为活性成分制备而 成的制剂。本发明制剂中，可以包括药物或保健品中可接受的辅料或辅助性成分。
[0025] 本发明所述辅料包括但不仅限于填充剂（稀释剂）、润滑剂（助流剂或抗粘着 剂）、分散剂、湿润剂、粘合剂、调节剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、崩解剂等。粘合剂包 含糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、纤维素及其衍生物（如微晶纤维素、羧甲基纤维 素钠、乙基纤维素或羟丙甲基纤维素等）、明胶浆、糖浆、淀粉浆或聚乙烯吡咯烷酮等；填充 剂包含乳糖、糖粉、糊精、淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、无机钙盐（如硫酸钙、磷酸 钙、磷酸氢钙、沉降碳酸钙等）、山梨醇或甘氨酸等；润滑剂包含微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石 粉、氢氧化铝、硼酸、氢化植物油、聚乙二醇等；崩解剂包含淀粉及其衍生物（如羧甲基淀粉 钠、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉、改良淀粉、羟丙基淀粉、玉米淀粉等）、聚乙烯吡咯烷酮或微 晶纤维素等；湿润剂包含十^烷基硫酸纳、水或醇等；抗氧剂包含亚硫酸纳、亚硫酸氛纳、 焦亚硫酸钠、二丁基苯酸等；抑菌剂包含0. 5%苯酚、0. 3%甲酚、0. 5%三氯叔丁醇等；调节 剂包含盐酸、枸橼酸、氢氧化钾（钠）、枸橼酸钠及缓冲剂等；乳化剂包含聚山梨酯-80、没酸 山梨坦、普流罗尼克F-68,卵磷酯、豆磷脂等；增溶剂包含吐温-80、胆汁、甘油等。
[0026] 所述辅助性成分，它具有一定生理活性，但该成分的加入不会改变上述组合物在 疾病治疗过程中的主导地位，而仅仅发挥辅助功效，这些辅助功效仅仅是对该辅助性成分 已知活性的利用，是医药领域惯用的辅助治疗方式。
[0027] 本发明通过HSCCC法，从全缘叶绿绒蒿中分离纯化出了式4化合物，经研究发现， 该化合物具有良好的清除自由基活性，可将其作为抗氧化的药物或保健品。
【附图说明】
[0028] 图1全缘叶绿绒蒿花粗提物的HSCCC色谱图
[0029] 图2不同摩尔浓度化合物、Vc和BHT清除DPPH活性图
[0030] 图中标记的数字" 1"、" 2 "、" 3 "、" 4 "，依次表示化合物" 1"、" 2 "、" 3 "、" 4 "。
【具体实施方式】
[0031] 实施例1本发明式4化合物的制备
[0032] (1)粗提物制备
[0033]称取全缘叶绿绒蒿花10g，打粉机粉碎，粉末不大于0.3mm(基本全部通过3号 筛），加70%乙醇（v/v) 200mL，超声（45kHz，300w)提取3次，每次45min，合并3次滤液，减 压回收乙醇，得浓缩液，将浓缩液置于-80°C冰箱过夜后，冷冻干燥，得干浸膏3. llg，干浸 膏得率为31. 1%。
[0034] 取浸膏约150mg，用50mL水溶解，转移至分液漏斗中，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃 取，合并乙酸乙酯和正丁醇萃取液，45°C减压回收溶剂，所得粗提物备用。
[0035] (2)分离纯化
[0036] 在分液漏斗中按乙酸乙酯/正丁醇/水（2 :3 :5，V/V/v)配置两相溶剂系统共2L， 充分振摇，静置分层。以上相为固定相，下相为流动相，将制备好的样品浸膏溶于20mL下相 中，备用。
[0037] 以20mL/min的流速将溶剂系统上相栗入主机充满分离螺旋管，循环水浴温度 35°C，UV检测波长254nm，转速900r/min，正转。转速稳定后，以流速2. OmL/min栗入下相， 待下相从管柱出口流出并且基线稳定后，将样品溶液由进样圈注入，根据色谱图手动收集 各色谱峰组分（见图1)。其中，收集出峰时间为420~450min的部位，减压除去溶剂后，所 剩固形物即为本发明化合物（llmg)。
[0038] 本发明出峰时间从栗入上相的时间算起。
[0039] 结构鉴定（结构鉴定数据见表2、3)
[0040] 式4化合物：黄色粉末，ESI-MS (负离子模式）：m/z 667. 23。本发明式4化合物 的分子量与文献[16]中 quercetin 3-〇-[2"'-0-acetyl-0-D-glucopyranosyl_(l - 6)-0-D-glucopyranoside]分子量一致。MS/MS 产生的二级碎片离子有 m/z 625. 13、607. 13、 301. 01，与 quercetin 3_0_[2"，_0_acetyl_ 0 _D_glucopyranosyl_ (1 一 6) _ 0 _D_glucopyr anoside] -致，丢失了碎片 CH3C00、C2H503、C14H 23012，并且二者1H-NMR 和 13C-NMR 数据相似， 可见二者为同分异构体，苷元为槲皮素。
[0041] 不同之处为乙酰基与槲皮素苷的联接位置。在HMBC图谱中，乙酰基的C = 0(5 c 169. 7)与 S H 4. 66 相关，S H 4. 66 与 C-2" '（ S c 71. 2)和 C-4" '（ S c67. 6)相关，HSQC 图 谱中，4.66与C-3"'77.8)相关，因此，可确定乙酰基与C-3"'相连，式4化合物 为 quercetin 3_0_[3'，' _0_acetyl_0 _D_glucopyranosyl_ (1 一 6)_0 _D_glucopyranosi de]，其结构式如下：
[0042]
[0043] 式 4
[0044] 采用上述方法，本发明还分别制备得到了化合物l"quercetin-3-0- 0 -D-glucopy rannosy_(l一6)-0 -D-glucopyranoside"，化合物2"quercetin3-〇-[2"，-0_acetyl-0 -D-glucopyranosyl_(l-6)-0 -D-glucopyranoside]"，化合物3"quercetin3-〇_[6"，-0-acetyl-员 _D_glucopyranosyl_(l- 6)_员 _D_glucopyranoside] '，，其结构式如下：