一种硅基罗丹明一氧化氮荧光探针及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化学和生物技术领域，具体地说，是一种硅基罗丹明一氧化氮荧光探 针及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] -氧化氮是生物体内一种十分重要的生物信息分子。体内的一氧化氮是由一氧化 氮合成酶（一氧化氮Synthetase, N0S)催化氧化L-精氨酸生成。研究表明，一氧化氮参与 生物体内许多重要的生理过程，特别是在心血管系统中发挥着重要的作用，具有舒张血管、 防止血栓形成、抗动脉粥样硬化等作用。人们对于一氧化氮进行了广泛和深入的研究，但 是一氧化氮分子化学稳定性差，在生物体内性质活泼，半衰期不足5秒；此外，作为一种亲 脂性的小分子，一氧化氮极易透过细胞膜，能够快速地从生成处迀移到其他组织细胞；生理 条件下，一氧化氮在细胞中的浓度极低，并且极易转变为其稳定代谢产物NO3和NO2。一氧 化氮的这些特点对实现在活细胞条件下对其进行实时、准确和直接监测提出了挑战。目前 用于一氧化氮监测的方法主要有荧光法、化学发光法、紫外_可见光谱法和毛细管电泳法 等。荧光分析法具有响应时间短、灵敏度高、仪器设备简单等诸多优点，并且其获得的信息 直观、准确，能科学表达解释生物复杂样品重分析物的分布及含量等诸多问题。这使得荧光 分析法成为在活细胞条件下监测内源性一氧化氮分子、研究其生理学功能最为行之有效的 一种方法。而检测一氧化氮的荧光探针多有报道，其中应用最为广泛的设计原理是利用邻 苯二胺在氧气存在下，能够与一氧化氮发生特异性反应，生成苯并三唑结构。利用这一特异 性反应，实现对荧光基团的调控，进而对一氧化氮分子进行检测。
[0003] 溶酶体是细胞内的消化器官，是由单层膜包被的囊状结构，内含多种水解酶，其 pH(~4. 5)低于胞浆内pH(~7. 0)，参与细胞的凋亡、吞噬等多种生理过程。有研究表明， 溶酶体的功能可能会受到一氧化氮的调控。实时监测线粒体和溶酶体内的一氧化氮水平具 有重要的研究价值和实用价值。HongZheng等人利用邻苯二胺与一氧化氮的反应特性，涉 及了一种基于罗丹明"开-关"环原理的一氧化氮小分子探针，可以实现对一氧化氮的选择 性荧光检测（〇rg.Lett. ,2008,10, 2357-2360);在此基础上，HaiboYu等人报道了一种具 有线粒体定位功能的一氧化氮荧光探针，可以定位于细胞的线粒体中，实现对细胞线粒体 内一氧化氮的检测（Anal.Chem.，2013, 85, 7076-7084)。专利中也有报道检测一氧化氮的小 分子荧光探针，如专利CN102617467A，CN103194214A，CN103923641A，CN104194773 A等，这些专利中所涉及的一氧化氮小分子荧光探针均利用邻苯二胺与一氧化氮的反应特 性而实现对一氧化氮的检测，特异性好，灵敏度高，但是均无法满足近红外检测的要求。中 国专利201310021200. 0,公开日2013年6月公开了一种荧光素内酰胺一氧化氮荧光探针的 制备和用途，该荧光内酰胺在水溶液中无荧光，当与一氧化氮反应开环水解生成有荧光的 荧光素衍生物。青岛科技大学2012年6月硕士学位论文《以罗丹明为骨架的N0分子荧光 探针的合成及性能研究》，其利用叔丁基苯酚、邻苯二甲酸、N，N二乙氨基苯酚、邻苯二胺为 原料合成以7位叔丁基取代的新型N0分子荧光探针，该探针对温度、pH有较好的稳定性， 但其与NO的反应时间长。以上所述荧光探针都能较好的特异性识别N0,但其以荧光素和罗 丹明为母体结构，以邻苯二胺为识别基团，激发波长和发射波长在可见光区，且不具备溶酶 体特异性定位功能。我们知道，细胞内一氧化氮产生量较少，且性质活泼，实现活细胞内一 氧化氮的荧光检测具有一定的难度，因此设计灵敏度高、特异性好的一氧化氮小分子荧光 探针具有重要意义。特别是特异性检测特定细胞器中一氧化氮的小分子探针，对于研究一 氧化氮在细胞内的分布情况及在生命活动中发挥的作用具有重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种硅基罗丹明一氧化氮荧光探 针。
[0005] 本发明的再一的目的是，提供如上所述的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针的制备方 法。
[0006] 本发明的另一的目的是，提供如上所述的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针的用途。
[0007] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0008] -种硅基罗丹明一氧化氮荧光探针，所述的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针为 SiRB-NO或Lyso-SiRB-NO;所述SiRB-NO结构如式（I)所示；所述Lyso-SiRB-NO结构如式
[11] 所示：
[0009]
[0010] 所述的Lyso-SiRB-NO具有溶酶体定位功能。
[0011] 所述硅基罗丹明一氧化氮荧光探针检测pH值为2-8 ;优选为2-5 ;最优为4-5。
[0012] 所述硅基罗丹明一氧化氮荧光探针在含20%乙腈的磷酸缓冲液中（10禮)，最 大激发波长为分别为 667nm(SiRB-N0,pH= 7. 4)，667nm(Lys〇-SiRB-N0,pH= 7. 4)， 67lnm(Lys〇-SiRB-N0,pH= 5. 0)，最大发射波长分别为 682nm(SiRB-N0,pH= 7. 4)， 680nm(Lys〇-SiRB-N0,pH= 7.4)，685nm(Lys〇-SiRB-N0,pH= 5.0)〇
[0013] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0014] 所述具有通式（I)结构的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针的制备方法包括如下步 骤：
[0015] 1)将SiRB与P0C13反应生成SiR-C0Cl;
[0016]2)将步骤1)的产物SiR-C0Cl与邻苯二胺反应生成SiRB-NO;
[0017]
[0018] 具体制备方法如下：
[0019]a、以1. 0当量的SiRB溶于1，2-二氯乙烷中，缓慢滴加5. 0当量的P0C13，回流反 应5小时，蒸干溶剂，固体用乙腈溶解；
[0020] b、将6. 0当量邻苯二胺溶于乙腈和三乙胺的混合溶剂中，将步骤a固体的乙腈溶 液缓慢滴加到该溶液中，室温下反应过夜，蒸干溶剂，加入CH2C12溶解，水洗，水层用CH2C12 萃取，合并CH2C1J1，水洗，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析，得探针SiRB-NO。其反应过程如 下：
[0022] 所述具有通式（II)结构的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针的制备方法包括如下步 骤：
[0023] 1)将Br-SiRB与P0C13反应生成Br-SiR-COCl;
[0024] 2)将步骤1)的产物Br-SiR-COCl与邻苯二胺反应生成Br-SiRB-NO;
[0025] 3)将Br-SiRB-NO与Cul、PdCl2(PPh3)2、N-炔丙基吗啉反应生成Lyso-SiRB-NO;
[0026]
[0027] 具体制备方法如下：
[0028]a、将1. 0当量的Br-SiRB-NO溶于1，2-二氯乙烷中，缓慢滴加5. 0当量的P0C13， 回流反应5小时，蒸干溶剂，固体用乙腈溶解；
[0029]b、将6. 0当量邻苯二胺溶于乙腈和三乙胺的混合溶剂中，将步骤a固体的乙腈溶 液缓慢滴加到该溶液中，室温下反应过夜，蒸干溶剂，加入CH2C12溶解，水洗，水层用CH2C12 萃取，合并CH2C1J1，水洗，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析，得探针Br-SiRB-NO;
[0030]c、将1. 0当量Br-SiRB-NO溶于等体积的THF和三乙胺的混合溶剂中，加入0. 4当 量Cul，0. 2当量PdCl2(PPh3)2,5. 0当量N-炔丙基吗啉，氩气保护，80°C下反应12小时后， 反应液倒入水中，〇12(：12萃取三次，合并CH不12层，水洗，无水硫酸钠干燥，柱层析，得探针 Lyso-SiRB-NO。其反应过程如下：
[0032] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
[0033] 如上所述的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针在检测一氧化氮中的应用。
[0034] 如上所述的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针在制备一氧化氮检测试剂中的应用。
[0035] 如上所述的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针在制备细胞染料、生物染色剂、生物分 子或生物粒子焚光标记中的应用。
[0036] 如上所述的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针在检测细胞