标志物及其应用、试剂盒、该标志物的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及标志物及其应用、试剂盒、该标志物的检测方 法。
【背景技术】
[0002] RA，rheumatoid arthritis，类风湿关节炎，是一种常见的慢性且很难治愈的疾病 (占世界人口的1 %左右），能导致全身关节不可逆性损坏，发病末期能导致残疾（约占1/4 患者），使患者丧失工作能力，严重影响患者生活质量，对患者和社会产生巨大的经济压力。 据报导，采用生物制剂治疗RA的患者，每年治疗费用将近要9万元左右。早期诊断与早期 治疗是缓解RA的关键。目前用于临床RA诊断的方法很多，ACR2010分类标准规定除了关 节受累数量和病程外，生物因子如RF，CCP，CRP等的含量与RA紧密相关。但是目前临床采 纳的多指标联合诊断（CCP/RF/GPI/AKA等）仍有一部分RA患者，尤其是早期患者不能及时 被确诊。
[0003] RA是一种自身免疫疾病，在发病过程中许多功能蛋白会发生非正常的翻 译后修饰，如括聚丝蛋白（Filaggrin，FLG)、波形蛋白（Vimentin)、a和0纤维蛋 白（a/0 Fibrin)、a-稀醇化酶（a -Enolase)及I型和II型胶原多肽（Type I and typeIIcollagen polypeptide)等会发生不正常翻译后修饰，这些非正常修饰的蛋白能激 起体内免疫系统反应产生自身抗体。目前临床使用的RA诊断方法中，大部分为自身抗体的 检测，如RF，ACPA，AKA等。其中，ACR2010分类标准推介的RF在RA疾病特异性比较低（低 于80%)，临床所用的CCP2的特异性可达到90%以上，但其灵敏度仅有70%左右，而在早 期RA患者中，CCP灵敏度只有不到50%。由于患者自身免疫系统的差异性以及自身抗体分 泌的之后性（相对于自生抗原），自身抗体的检测显然不能完全与RA病情尤其是RA早期的 病情相符，自身抗原的检测在自身免疫疾病的诊断方面具有很大的潜力。但是，目前市场上 还没有以自身抗原为检测目标的用于RA临床诊断的试剂和方法还没有出现。因此新的更 具诊断意义的生物标志物开发成为突破RA诊断方法的关键。
[0004] 纤维蛋白原，Fibrinogen，是血液中促血凝与血栓形成因子。许多报道在RA患 者的体液中存在翻译后修饰的纤维蛋白原（包括糖基化，羰基化，瓜氨酸化以及其他修 饰）（PTM-F)。大量的实验数据证明将人工修饰的纤维蛋白原能诱导RA的并情更加严 重，暗示了非正常修饰的纤维蛋白原可能与RA的发病机制有关。但是，Takizawa和其 同事（Takizawa等，2006)用ELISA法检测瓜氨酸化纤维蛋白原发现，在针对来自类风 湿性关节炎患者之滑液的ELISA中检测到阳性信号，但是所有RA(包括对照）血浆样 本仍为阴性，Takizawa认为纤维蛋白原在血液中是非瓜氨酸化的。本发明用不同的酶 (Glucosyltransferase, Peptidyl Arginine Deaminase，Carboxydismutase 等）处理 RA 关节滑膜特异性蛋白，并用修饰后蛋白免疫兔子，获得特制的IgG抗体，用于检测RA患者血 清样本中的非正常修饰抗原。
[0005] RA会导致不可逆关节损坏，早诊断和早治疗是缓解病情的关键。但是，目前临床 采纳的多指标联合诊断（CCP/RF/GPI/AKA等）仍有一部分RA患者不能及时被确诊。RF和 CCP是2010ACR标准所推荐的诊断因子，其中，RF的特异性比较低（不到80% )，而目前临 床所用的CCP2的特异性可达到90%以上，但灵敏度为70%左右，在早期RA患者中，CCP灵 敏度只有不到50%，RA诊断遇到了瓶颈。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明提供标志物及其应用、试剂盒、该标志物的检测方法。本发明检 测的PTM-F是与RA病理相关的自身抗原。在RA患病早期会发生纤维蛋白原的不正常翻译 后修饰，因此PTM-F在RA患病早期检出。另外，本发明排除因为自身免疫系统差异导致的 诊断结果与RA病情不符的现象。本发明检测的PTM-F在RA患者血清中具有很高的特异性 (90%以上）与灵敏度（80%以上），且能反应患者病理信息，具有很高的RA诊断意义。本 发明检测的PTM-F蛋白，目标明确，检测时用特异性单抗捕捉目标蛋白，可以很大程度上降 低非特异性信号，避免背景信号干扰以及假阳性现象。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0008] 本发明提拱了一种标志物，其为翻译后修饰纤维蛋白原（PTM-F)。
[0009] 通过对正常人血清，相关疾病患者血清及RA患者血清共821例样本分析，发现在 RA患者血清样本中的非正常修饰的纤维蛋白原（PTM-F)的含量要明显高于正常人血清样 本，且在其他相关疾病如骨关节炎，系统性红斑狼疮等患者血清中含量和正常人中非常低， 表明PTM-F具有很高的RA疾病特异性（95 %左右）。并且，采用我们特殊的样品处理方法 与设计的ELISA实验参数，通过对57例确诊为RA患者（根据ACR2010RA分类标准打分，不 低于6分）的血清样本测定结果统计表明，PTM-F在57例RA患者中有47例呈阳性（根据 95%特异性时设定cut off值），灵敏度高达为82%。我们现有的数据显示，以患者的血清 为检测样本，PTM-F在RA患者，尤其是早期RA患者中，有很高的临床诊断价值。本发明即 是基于以PTM-F为检测目标开发的RA诊断方法。
[0010] 虽然RA的致病机理目前研究并不清楚，但有实验证明将瓜氨酸化纤维蛋白原注 入动物体类，能加剧RA的病情，由此推测瓜氨酸化纤维蛋白原与RA的发病机制有很大的关 联。因此，本发明以PTM-F为检测目标，不仅能高灵敏度确诊RA，还能提供一定的病理信息， 以指导临床制定个性化治疗方案。
[0011] 在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的标志物所述翻译后修饰纤维蛋白 原（PTM-F)的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0012] 所述纤维蛋白原的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示（突出标记部分为潜在的翻译 后修饰位点）。SEQ ID No. 1所示：
[0013]
[0014] 在本发明的一些实施例中，所述翻译后修饰为点选自第5位、第35位、第38位、第 42位、第69位、第84位、第114位、第123位、第129位、第135位、第137位、第143位、第 160位、第168位、第178位、第181位、第186位、第190位、第216位、第218位、第258位、 第263位、第271位、第287位、第308位、第353位、第367位、第394位、第414位、第425 位、第426位、第443位、第458位、第459位、第510位、第512位、第547位、第573位、第 591位、第621位、第627位、第630位。
[0015] 在本发明的一些实施例中，所述修饰为瓜氨酸化或氨基甲酰化。
[0016] 在本发明的一些实施例中，所述翻译后修饰纤维蛋白原为瓜氨酸化纤维蛋白原和 /或氨基甲酰化纤维蛋白原。
[0017] 在本发明的一些具体实施方案中，所述翻译后修饰纤维蛋白原（PTM-F)具体为瓜 氨酸化纤维蛋白原和氨基甲酰化纤维蛋白原。
[0018] 本发明还提供了所述标志物的抗体在制备类风湿关节炎的诊断试剂或诊断工具 中的应用。
[0019] 在本发明的一些具体实施方案中，所述应用中所述诊断工具为诊断试剂盒。
[0020] 本发明还提供了一种试剂盒，包括抗翻译后修饰纤维蛋白原抗体和检测中可接受 的试剂。
[0021] 在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的所述试剂盒中所述试剂还包括载 体、封闭液、洗涤液、样品稀释液、标记抗体、底物、显色液、终止液中的一种或两者以上的混 合物。
[0022] 在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的所述试剂盒中所述试剂盒在检测 类风湿性关节炎中的应用。
[0023] 本发明提供的所述标志物的检测方法，包括如下步骤：
[0024] 步骤1 :取载体包被所述抗翻译后修饰纤维蛋白原抗体，与待测样品混合，孵育， 获得包含有样品待测液的载体；
[0025] 步骤2 :取载体包被所述抗翻译后修饰纤维蛋白原抗体，与阴性参考样品混合，孵 育，获得包含有阴性参考样品待测液的载体；
[0026] 步骤3 :分别取步骤1制得的包含有样品待测液的载体与步骤2制得的包含有阴 性参考样品待测液的载体，洗涤后，分别与标记二抗混合，孵育，洗涤，显色，检测所述待测 样品的光吸收值和所述阴性参考样品的光吸收值，获得所述标志物的浓度。
[0027] 在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的所述标志物的检测方法步骤3中 所述获得所述标志物的浓度=所述待测样品的光吸收值/所述阴性参考样品的光吸收值。
[0028] 在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的所述标志物的检测方法中根据所 述标志物获得的检测结果为半定量检测结果，用S/N值来表示；
[0029] 吸光度比值（S/N)=待测样品孔的光吸收值/阴性参考样品孔的光吸收值
[0030]