一种抗hpv6l1蛋白的抗体、其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学领域，更具体地，本发明涉及一种特异性结合人乳头瘤病毒 HPV6L1蛋白的抗体、制备方法及其在制备体外检测试剂盒中的应用。
【背景技术】
[0002] 人乳头瘤病毒（HPV)是一组无包膜的小DNA病毒，感染人皮肤及粘膜上皮组织，可 诱发产生疣状增生乃至引发良性或恶性肿瘤。根据感染后诱发病变的良恶性不同分为高危 型HPV和低危型HPV。高危型HPV感染与宫颈癌及癌前病变的发生密切相关，此外还与粘膜 相关的癌及癌前病变的发生相关。高危型HPV感染相关的恶性病变中以妇女宫颈癌的发病 率最高，全球范围内的发病率仅次于乳腺癌，高居妇科恶性肿瘤的第二位。低危型HPV主要 引起皮肤黏膜的疣状增生，表现为尖锐湿疣、扁平疣等良性病变。流行病学调查及临床研究 表明，生殖器尖锐湿疣组织中以HPV6和HPV11型检出率最高，约占低危型别的70%以上。 预防HPV感染最有效的方法是接种HPV疫苗，目前已上市的HPV疫苗，包括Merck公司的四 价疫苗"Gardasil"和九价疫苗"Gardasil9"，以及GSK公司的双价疫苗"Cervarix"，这三 种疫苗都包含HPV6型的疫苗成分，HPV疫苗能够刺激机体产生保护性中和抗体，在有效的 预防HPV感染及宫颈癌中具有重要意义。
[0003] 研究发现，具有中和能力的单抗基本都识别构象表位，并且大多数识别型特异性 构象表位的单克隆抗体都具有中和能力。不同中和单抗通过封闭病毒与细胞第二受体的结 合位点，可阻止病毒感染入胞的发生，对这些单抗结合表位的研究有利于解释病毒感染入 胞的关键位点。目前多数认为，在动物的HPV感染中，血清IgG(主要是中和IgG)能以足够 高的浓度穿过宫颈上皮，特别是在鳞状、柱状上皮结合处，从而与病毒颗粒结合并阻止感染 发生。对疫苗诱发产生的中和抗体活性的测定是检测预防性疫苗免疫保护性的重要标准。 中和活性抗体在HPV疫苗的免疫原性检测和含量测定中具有重要的应用前景。
[0004] 由于目前还未出现针对HPV6的更有效的特异性抗体，因此寻找这样一种抗体，并 将其应用于HPV6感染的诊断、检测中十分必要。
【发明内容】
[0005] 为了解决以上技术问题，本发明的一个方面是提供一种特异性结合人乳头瘤病毒 HPV6的L1蛋白和/或VLP的抗体，其特征在于，包含有SEQ ID N0. 1-3所示的重链可变区 的CDR1、CDR2和CDR3区域和SEQ ID N0. 4-6所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区 域。
[0006] 本发明的另一个方面是提供一种特异性结合人乳头瘤病毒HPV6的L1蛋白和/或 VLP的抗体，包含有如SEQ ID N0. 13所示的重链可变区氨基酸序列和如SEQ ID N0. 14所示 的轻链可变区氨基酸序列。
[0007] 本发明所述抗体均为单克隆抗体。
[0008] 作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述抗体是由保藏编号为CGMCC NO. 10957的细胞产生的单克隆抗体。所述细胞是由免疫后的宿主脾细胞和骨髓瘤细胞融合 得到的杂交瘤细胞，其被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)， 保藏编号为CGMCC NO. 10957,保藏日期为2015年7月6日。
[0009] 本发明中所述抗体为型别特异性抗体，仅能特异性的结合HPV6L1蛋白和/或VLP， 而对其他大部分的 HPV 型别均无反应，如 HPV11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、 68等型别。
[0010] 在本发明中，所述抗体具有中和活性，可阻断HPV6型假病毒感染293FT细胞，具有 中和假病毒的作用。
[0011] 作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述抗体是单价或二价抗体。
[0012] 在本发明中，可以采用Kohler等在Nature 256:495(1975)中报道的杂交瘤制备 方法来制备所述单克隆抗体。首先用免疫原（必要时候添加佐剂）免疫注射小鼠或其它合 适的宿主动物。在本发明中，所述免疫原是汉逊酵母细胞表达产生的经过层析纯化后得到 的HPV6L1蛋白和/或该HPV6L1蛋白在体外自动组装形成的病毒样颗粒（VLP)。其抗原的 氨基酸序列如SEQ ID N0. 21所示。
[0013] 免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。佐剂可以利用弗氏佐 剂（弗氏完全性佐剂或者弗氏不完全性佐剂）或MPL-TDM等。动物在接受免疫后，体内会产 生分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞。收集目的淋巴细胞，并用合适的融合剂（如 PEG4000)将其与骨髓瘤细胞融合，从而获得杂交瘤细胞（Goding，Monoclonal Antibodies : Principles and Practice，pp. 59-103, Academic Press，1996)〇
[0014] 将上述制备的杂交瘤细胞接种到合适的培养基中进行生长，所述培养基中含有一 种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤 磷酸转移酶（HGPRT或HPRT)的母体骨髓瘤细胞，在培养基中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸 腺嘧啶（HAT培养基）等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。
[0015] 优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对HAT培养基敏感 等能力。其中，骨髓瘤细胞首选鼠源骨髓瘤，如M0P-21和MC-11小鼠肿瘤衍生株（THE Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，Calif. USA)，以及 SP-2/0 或 X63_Ag8_653 细胞株（American Type Culture Collection，Rockville，Md. USA)。另 外，还可以利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗（Kozbor，J. Immunol.， 133:3001(1984) ；Brodeur et al. ， Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp. 51-63, Marcel Dekker，Inc.，New York，1987) 〇
[0016] 杂交瘤细胞生长的培养基用于检测针对特异抗原的单抗的产生。可以使用 下列方法来测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性：免疫沉淀或体外结合试验， 如放射免疫试验（RIA)、酶联免疫吸附试验（ELISA)。例如，利用Munson等在Anal. Biochem. 107:220(1980)中描述的Scatchard分析法可测定单抗的亲和力。
[0017] 在确定杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性之后，目的细胞株可以通过 Coding,Monoclonal Antibodies principles and Practice，pp. 59-103,Academic Press， 1996描述的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养基可以是DMEM或RPMI-1640等。另外， 杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。
[0018] 利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电 泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出 来，进而得到所述单克隆抗体。
[0019] 作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述得到的单克隆抗体为5H3。
[0020] 本发明的另一个方面是提供了一种特异性结合人乳头瘤病毒HPV6的L1蛋白和/ 或VLP的抗原结合部分，包含有SEQ ID N0. 1-3所示的重链可变区的⑶R1XDR2和⑶R3区 域和SEQ ID N0. 4-6所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。
[0021] 其中，所述抗原结合部分选自Fab、Fab'、F(ab'）2、Fd、dAb、互补决定区片段、单链 抗体，人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。
[0022] 所述特异性结合HPV6的L1蛋白和/或VLP的抗原结合部分可使用本领域技术 人员公知的方法获得，如利用化学试剂处理的方法，或利用蛋白酶消化的方法，如木瓜蛋白 酶、胃蛋白酶等。
[0023] 本发明的另一个方面是提供了一种保藏编号为CGMCC N0. 10956的杂交瘤细胞，其 被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏日期为2015年7 月6日。
[0024] 本发明的另一个方面是提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明的特异性结合 人乳头瘤病毒HPV6的L1蛋白和/或VLP的抗体或其抗原结合部分。
[0025] 作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述试剂盒中还包含与HPV6的L1蛋白和 /或VLP特异性结合的第二抗体。
[0026] 在上述试剂盒中，所述第二抗体可以为有技术中已知的任意抗HPV6L1蛋白和/或 VLP的抗体，从而利用双夹心法对样品进行检测。
[0027] 作为优选，所述第二抗体包含有SEQ ID N0. 7-9所示的重链可变区的⑶R1、⑶R2 和CDR3区域和SEQ ID N0. 10-12所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。
[0028] 作为优选，所述第二抗体包含有如SEQ ID N0. 17所示的重链可变区氨基酸序列和 如SEQ ID N0. 18所示的轻链可变区氨基酸序列。
[0029] 作为优选，所述第二抗体包含有如SEQ ID N0. 19所示的重链可变区核苷酸序列和 如SEQ ID N0. 20所示的轻链可变区核苷酸序列。
[0030] 更优选地，所述第二抗体是由保藏编号为CGMCC N0. 10956的细胞产生的单克隆抗 体。
[0031] 更优选地，所述第二抗体为4F8。
[0032] 作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述第二抗体采用与本发明所述特异性 结合人乳头瘤病毒HPV6的抗体相同的方法制备。
[0033] 本发明的另一个方面还提供了上述试剂盒在检测样品中HPV6的和/或VLP存在 或者水平中的用途。
[0034] 本发明的有益效果：
[0035] 本发明提供的特异性结合人乳头瘤病毒HPV6L1蛋白和/或VLP的抗体或抗原结 合部分与大部分的册￥其他亚型，如册￥11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68 等型别无交叉反应，特异性高，具有中和HPV6假病毒并阻断其感染的特性，且亲和性高。可 用于检测样品中HPV6L1蛋白和/或VLP的存在或水平试剂盒的研发，以及针对患者的治疗 和对易感人群进行被动免疫，具有良好的应用前景。
[0036] 生物保藏信息：
[0037]保藏编号：CGMCCN0.10957
[0038] 保藏日期：2015年7月6日
[0039] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所
[0040] 分类命名：杂交瘤细胞株
[0041] 保藏编号：CGMCC N0. 10956
[0042] 保藏日期：2015年7月6日 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京 市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所 分类命名：杂交瘤细胞株
【附图说明】
[0043] 图1为本发明实施例1(1)中制备的抗原HPV 6L1-VLP的电镜观察结果。序列说 明
[0044] SEQ ID N0. 1-3为本发明抗体或抗原结合部分的重链可变区⑶R1-3的氨基酸序 列；
[0045] SEQ ID N0. 4-6为本发明抗体或抗原结合部分的轻链可变区⑶R1-3的氨基酸序 列；
[0046] SEQ ID N0. 7-9为本发明第二抗体的轻链可变区CDR1-3的氨基酸序列；
[0047] SEQ IDN0.10-12为本发明第二抗体的轻链可变区CDR1-3的氨基酸序列；
[0048] SEQ ID N0. 13为本发明抗体的重链可变区氨基酸序列；
[0049] SEQ IDN0.14为本发明抗体的轻链可变区氨基酸序列；
[0050] SEQ ID N0. 15为本发明抗体的重链可变区核苷酸序列；
[0051] SEQ IDN0.16为本发明抗体的轻链可变区核苷酸序列；
[0052] SEQ ID N0. 17为本发明第二抗体的重