因子viii融合蛋白的制作方法
【专利说明】因子VIII融合蛋白
[0001] 本申请是申请日为2011年2月10日，申请号为201180009864. 4的、发明名称和 本发明相同的发明专利申请的分案申请。 发明领域
[0002] 本发明涉及经修饰的凝血因子。特别是，本发明涉及与非同源多肽融合的因子 VIII分子，所述多肽为例如抗体结合多肽，例如Fc受体或Fc结构域。本发明还涉及所述分 子的用途以及所述分子的生产方法。
[0003] 发明背景 A型血友病是由凝血因子VIII (FVIII)活性缺乏或功能障碍所致的一种遗传性出血 性疾病。临床表现不在于最初的止血，即血块的形成正常发生，但血块因缺乏相继的凝血酶 形成而不稳定。该病通过静脉内注射从血液中分离的或重组产生的凝血因子FVIII而得以 治疗。
[0004]目前的治疗推荐由传统的按需治疗向预防转变。与冯维勒布兰德因子（von Willebrandt Factor)结合的内源FVIII的循环半衰期是12-14小时，因此预防性治疗应一 周进行数次，以使患者获得几乎无症状的生活。IV给予对于许多人，尤其是儿童和年轻人而 言伴随明显的不便和/或痛苦。
[0005] 在具有显著延长的循环半衰期的因子VIII变体的开发中已经采用多种方法。很 多这类方法都涉及到将因子VIII与亲水性聚合物例如PEG (聚乙二醇）缀合在一起。
[0006] 因此本领域需要具有因子VIII活性的新的因子VIII产品，其包括一种或多种以 下特征：优选在结构上是同源的，优选为安全的，优选为生物可降解的，并优选具有显著延 长的循环半衰期，以减少每周给予因子VIII的次数。本领域同样需要用于提供这类分子的 相对简单的方法。
[0007]发明概述 本发明涉及重组因子VIII分子，其中所述因子VIII分子是融合蛋白。本发明还涉及 所述分子的制备方法以及所述分子的用途。所述分子优选具有改良的循环半衰期。
[0008] 发明描述 定义 融合蛋白：融合蛋白/嵌合蛋白，是通过原本编码分开的蛋白质的两种以上基因结合 而产生的蛋白质。该融合基因经翻译而得到具有来源于每个原有蛋白质的功能特性的单个 多肽。可将本发明的因子VIII分子与另一多肽融合。优选地，因子VIII融合蛋白将具有 比非融合因子VIII分子更长的循环半衰期。
[0009] 可将很多种融合配偶体与FVIII部分结合起来。这些融合配偶体可通过不同机制 改变融合蛋白相对于野生型FVIII的性能。
[0010] 推定多种融合配偶体通过与新生儿Fc受体（FcRn)相互作用而延迟FVIII的体内 清除。推定通过与FcRn相互作用而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是免疫球蛋白 Fc结构域、人血清白蛋白（hSA)和转铁蛋白或这些蛋白的组成部分。由与推定通过与FcRn 相互作用而延迟FVIII的多肽结合的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表2。 尽管因为IgG抗体的相对长的循环半衰期而通常优选IgG Fc结构域，但"Fc融合衍生物" 或"Fc融合蛋白"在本文中意指包括与可来源于任何抗体同种型的Fc结构域融合的本发明 FVIII变体。Fc结构域还可经修饰以调节某些效应子功能，例如补体结合和/或与某些Fc 受体结合。FVIII与具有与FcRn受体结合的能力的Fc结构域的融合，通常将会导致融合蛋 白的循环半衰期延长（与wt FVIII的半衰期相比）。在IgG Fc结构域中234、235和237 位的突变通常将会导致与Fc y RI受体的结合减少，还可能导致与Fc y Rlla和Fc y RIII受 体的结合减少。这些突变不改变与FcRn受体的结合，其通过内吞再循环途径而促进了长循 环半衰期。优选地，本发明的融合蛋白经修饰的IgG Fc结构域包含一个或多个以下突变， 所述突变将会分别导致对某些Fc受体的亲和力下降（L234A、L235E和G237A)以及Clq-介 导的补体结合降低（A330S和P331S)。
[0011] 然而，本发明也包含这样的FVIII变体：其与例如与新生儿Fc受体的结合特性发 生改变的Fc结构域融合。如果例如Fc结构域变体具有增加的与例如新生儿Fc受体的亲 和力，可能融合蛋白的体内循环半衰期将得到进一步延长。据信调节Fc结构域与新生儿Fc 受体的亲和力的人IgG中氨基酸置换的实例是T250Q、M252Y、S254T、T256E、P257I、T307A、 Q311I和M428L (残基编号按照EU索引）。
[0012] 推定其它融合配偶体通过与免疫球蛋白相互作用而延迟FVIII的体内清除。推定 通过与免疫球蛋白相互作用而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是Fc受体，例如 FcyRI (⑶64)或FcRn或这些蛋白的组成部分。由与推定通过与免疫球蛋白相互作用而延 迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表3。
[0013] 推定某些融合配偶体通过减少与清除受体的相互作用而延迟FVIII的体内清除。 推定通过减少与清除受体的相互作用而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是低密 度脂蛋白受体家族Fc受体成员，例如低密度脂蛋白受体相关蛋白或这些蛋白的组成部分， 例如重复簇5 (CR5)、6 (CR6)和/或7 (CR7)。由与推定通过减少与清除受体的相互作用 而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表4。
[0014] 推定其它融合配偶体通过与血小板相互作用而延迟FVIII的体内清除。推定通过 与血小板相互作用而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是与血小板表面上的蛋白 质例如GPIIIa结合的单链（SC)抗体。在SC抗体中，源自免疫球蛋白重链的多肽序列可位 于源自免疫球蛋白轻链的多肽序列的N-端。该顺序称为HC-LC。源自免疫球蛋白重链的多 肽序列也可位于源自免疫球蛋白轻链的多肽序列的C-端。这后一种顺序称为LC-HC。由与 推定通过与血小板相互作用而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限 制性实例见表5。
[0015] 推定一些融合配偶体通过与血清白蛋白相互作用而延迟FVIII的体内清除。推定 通过与血清白蛋白相互作用而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是单链抗血清白 蛋白抗体（SC抗HSA)和白蛋白结合多肽例如ABD035多肽。白蛋白结合多肽可重复若干次， 例如4次重复，正如在4XABD035融合配偶体中所示。由与推定通过与血清白蛋白相互作用 而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表6。
[0016] 推定其它融合配偶体通过保护（shielding)而延迟FVIII的体内清除。推定通 过保护而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是具有非疏水性氨基酸段例如序列A (seq A)的多肽或充满弹性蛋白样多肽（ELP)例如ELP60的多肽。由与推定通过保护而延 迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表7。
[0017] 推定某些融合配偶体通过调节与vWF的亲和力而延迟FVIII的体内清除。推定通 过调节与vWF的亲和力而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是FVIII的a3区（野 生型人FVIII的氨基酸1649-1689)或a3区的部分，因此给FVIII添加一个或多个额外的 a3区。由与推定通过调节与vWF的亲和力而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融 合蛋白的非限制性实例见表8。
[0018] 推定某些融合配偶体通过尚待确定的机制而延迟FVIII的体内清除。推定通过尚 待确定的机制而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是生长激素结合蛋白（GHBP)、凝 血因子IX (FIX)部分、vWF部分、vWF结合蛋白、绒毛膜促性腺激素部分和凝血因子X(FX)部 分。源自FIX的融合配偶体的非限制性实例是人FIX的氨基酸298-342 (FIX298-342)和人 FIX的氨基酸47-125 (FIX47-125)。源自vWF的融合配偶体的非限制性实例是人vWF的氨 基酸 1-272 (vWFl-272)、人 vWF 的氨基酸 1-1390 (vWFl-1390)和人 vWF 的氨基酸 497-716 (VWF497-716)。源自绒毛膜促性腺激素的融合配偶体的非限制性实例是人绒毛膜促性腺激 素0 _链的C-端28个氨基酸（hCG C-端）。源自FX的融合配偶体的非限制性实例是人 FX活化肽（F10AP)。由与推定通过尚待确定的机制而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分 组成的融合蛋白的非限制性实例见表9。
[0019] 推定某些融合配偶体通过调节与脂质的亲和力而延迟FVIII的体内清除。推定通 过调节与脂质的亲和力而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是FVIII的C2结构域， 因此给FVIII添加一个或多个额外C2结构域。由与推定通过调节与脂质的亲和力而延迟 FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表10。
[0020] Fc受体：Fc受体是识别和结合抗体的Fc部分的细胞表面受体。根据其结构、细胞 分布和与IgG的亲和力，将Fc受体分为3类：FcyRI (CD64)、FcyRII (CD32)和FCyRIII (CD16)。依据本发明，与因子VIII分子融合的Fc受体可以是全长或部分长度的Fc受体、 及其任何变体（变体包括氨基酸取代、缺失和添加）。如果它们是部分长度的，则应保留与 抗体结合的能力。
[0021] 冯维勒布>德闵子（vWF):vffF是存在于血浆中并在内皮（在怀布尔-帕拉德体 中）、巨核细胞（血小板a-颗粒）和内皮下结缔组织中组成性地产生的一种大的单聚/多 聚糖蛋白。其主要功能是与其它蛋白、尤其是与因子VIII结合，并且它在血细胞粘附于受 伤部位中是重要的。
[0022] 因子VIII与vWF结合的同时在循环中失活；因子VIII当未与vWF结合时快速降 解或被清除。因此由此断定，迄今已认为降低或消除FVIII的vWF结合能力在获取具有延 长循环半衰期的因子FVIII变体中是非常不希望的途径。
[0023] 术语"与vWF的结合能力降低"在本文中意指包括因子VIII变体，其中与vWF的 结合能力降低至少50%，优选至少60%、更优选至少70%、更优选至少80%、更优选至少90%、 和最优选约100%。FVIII与vWF的结合可通过ELISA样测定来检测或使用表面等离振子共 振来测定为与固定化vWF的直接结合。在因子VIII中负责与vWF结合的区域是跨越残基 1670-1684的区域，其公开于EP0319315。设想涉及该区域的因子VIII点突变和/或缺失 突变（deltion mutatant)将会改变与vWF结合的能力。本发明特别优选的点突变的实例 包括包含一个或多个以下点突变的变体：Y1680F、Y1680R、Y1680N、和E1682T、和Y1680C。
[0024]_子VIII分子：FVIII/ _子VIII是主要由肝细胞产生的一种大而复杂糖 蛋白。FVIII由2351个氨基酸组成，包括信号肽，并含有由同源性限定的若干不同结 构域。有3个A结构域、1个独特的B结构域和2个C结构域。结构域的顺序可列为 NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H。FVIII在血浆内以在B-A3边界分开的2条链而循环。这两条 链通过二价金属离子结合而连接。A1-A2-B链称为重链（HC)，而A3-C1-C2称为轻链（IX)。
[0025] 内源因子VIII分子在体内作为具有不同大小的B结构域的分子库而循环。在体 内可能发生的是对B结构域的逐步酶切除，产生具有不同大小的B结构域的分子库。通常 认为在740位的切割（B结构域的最后部分正是因此而被切除）的发生与凝血酶激活相关。 然而，这并不能排除因子VIII变体（其中例如在740位的切割位点已经受损）可具有活性。
[0026] 本文所用的"因子VIII "或"FVIII "是指作为内源性凝血途径的成员并对凝血而 言至关重要的人血浆糖蛋白。"天然FVIII"是如SEQ ID NO. 1 (氨基酸1-2332)所示的 全长人FVIII分子。B结构域跨越SEQ ID NO 1中的氨基酸741-1648
[0027] 本发明的因子VIII分子可以是B结构域截短的因子FVIII分子，其中剩余结 构域基本对应于SEQ ID NO 1中氨基酸编号1-740和1649-2332所示序列，尽管在残基 1670-1684之间的vWF结合区内可能也有例如一个或多个改变。然而，本发明的B结构域 截短的分子可与SEQ ID NO 1所示序列具有微小差异，意即剩余结构域（即3个A结构域 和2个C结构域）与SEQ ID NO 1所示氨基酸序列（氨基酸1-740和1649-2332)可具有 微小差异，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异或约1%、2%、3%、4%或5%差异，这是 因为可引入突变以降低例如vWF结合能力这一事实。此外，可能在分子的其它位置导入氨 基酸修饰（取代、缺失等），以改变