一种海洋微生物菌株Y112及其产α-环糊精葡萄糖基转移酶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及海洋微生物领域，特别是设及一种海洋微生物菌株Y112及其产的 a-环糊精葡萄糖基转移酶。
【背景技术】
[0002] 环糊精（cyclodextrin，缩写CD)是由a-1, 4-糖巧键相连而成的，环状的，无还原 端的麦芽低聚糖。环糊精通常由6、7或8个葡萄糖残基组成，分别被称为a-、e-、或丫-环 糊精。除了运S种常用的环糊精外，还有5-、e-、C-和n-环糊精（分别由9~12个葡 萄糖单元组成）。环糊精具有能够将多种化学物质全部或部分封装入空腔内的能力，从而改 变了运些化合物的物理和化学性质。环糊精是由环糊精葡萄糖基转移酶（CG化Se)作用于 淀粉转化而成，主要产物为a-、0-、丫-环糊精的混合物。由于环糊精分离提纯工艺非常 复杂，因此寻找能催化产生特定环糊精的CG化Se的产生菌非常重要。目前，研究报道主要 集中在0-CG化Se产生菌株上，而有关a-、丫-CG化Se产生菌的研究报道却很少。几乎很少 有主要产Q-或丫-环糊精的CG化Se报道。枯草芽抱杆菌BacillussubtilisNo. 313、嗜碱 芽抱杆菌Bacillusstrain290-3、芽抱杆菌Bacillussp.Ak6 和短杆菌Rrevibacterium sp.No9605是目前已知的产丫-CG化Se的菌株。
[0003] 目前环糊精的制备主要是采用酶法合成的，而酶法制备会产生多种环糊精的混合 物，不利于生产单一环糊精及分离纯化，运极大限制了环糊精的应用。因此，寻求一种能够 生产特定单一a-环糊精Q--CG化Se的生产菌，克服目前酶法制备产生多种环糊精混合 物，降低环糊精生产成本，成为当今世界开发产酶菌，促进环糊精在医药、食品、化工、化 妆品、工业和农业W及分析化学等方面得到广泛的应用关注的焦点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术酶法产生多种环糊精的混合物的不足，经发明 人长期开发研究海洋微生物及其酶产物和生产实践，开发提供一种产单一a-环糊精葡萄 糖基转移酶的海洋微生物菌株Y112及其产的a-环糊精葡萄糖基转移酶。
[0005] 本发明提供一种产单一a-环糊精葡萄糖基转移酶的海洋微生物菌株Y112(简称 菌株Y112)来自黄海海域，将得到的序列用GenBank中的BLAST进行比对分析。测序得到 长度约1420bp左右的16SrDNA序列，碱基组成如图1。采用Nei曲bor-化ining方法构建 系统发育树如图2,结果表明菌株Y112与Bacillus属成员具有较高的序列相似性，因此属 于芽抱杆菌属。同时菌株Y112与Bacillusagara化aerensDSM8721的同源性达100%，说 明菌株Y112与DSM8721亲缘性很近。经过16SrDNA序列分析结合其生理生化特征，该菌 株被鉴定为芽抱杆菌属度acillusSP.)。该产〇-〔6化36的海洋微生物菌株￥112于2015 年7月13日保藏于中国武汉中国典型培养物保藏中屯、（简称CCTCC)，保藏号为CCTCCNO: M2015447。
[0006] 海洋微生物菌株Yl12的形态和生理生化特征：
[0007] 菌株Yl12的形态特征：
[0008] 菌株Y112为不规则短杆状，革兰氏阳性，菌落在琼脂培养基上呈现圆形，乳白色， 表面平坦、边缘不整齐。
[0009] 菌株Yl12生理生化特征：
[0010] 菌株Y112能在抑8. 0-11.0的条件下生长，最适生长抑为10 ;生长的溫度范围为 10-45°C，最适生长溫度33°C;最高能耐受16wt%的化Cl,在含有5%Wt化Cl条件下生长量 最高。菌株Y112能够分解淀粉、明胶、Tween40或Tween60,不能分解Tween20。氧化酶、 过氧化酶或硝酸盐还原结果为阳性，硫化氨、吗I噪产生试验结果为阴性。菌株Y112还能够 利用精氨酸、巧樣酸、尿素或薦糖，不能利用赖氨酸、鸟氨酸、葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、 鼠李醇或阿拉伯糖。 W11] 菌株Y112-16SrDNA的PCR扩增和序列分析：
[0012] 对菌株Y112的16SrDNA序列进行PCR扩增，测序得到长度约1420bp左右的16S rDNA序列，碱基组成如图1。
[0013] 一、产a-CG化Se的海洋微生物菌株Y112的选育与鉴定：
[0014] 1、粗酶液的制备
[0015] 在装种子培养基液30mL的S角瓶中接种海洋微生物菌株Y112后，30°C、200r/min 下活化22h，W4% (V/V)的接种量接种至装有25mL发酵培养基的S角瓶中，27°C、230r/ min培养50h，收集发酵液在1000 Og的离屯、力条件下离屯、15min，上清为粗酶液。所述种子培 养基的组成：每升培养基含可溶性淀粉lOg，蛋白腺5g，酵母浸粉5g，KzHPOJg,M拆〇4?7&0 0. 15g，化Cl50g，121°C灭菌20min。所述发酵培养基的组成：每升培养基含玉米淀粉lOg， 蛋白腺5g，酵母浸粉5g，KzHPOJg，MgS〇4 ?%0 0. 15g，化Cl50g混合均匀，121°C灭菌 20min ;
[0016] 本发明中酶活的测定采用甲基澄稱色法。该酶活单位定义为上述条件下生成 1yga-环糊精所需的酶量
[0017] 生物量的测定：采用比浊法测定生物量。
[0018] 2、a -环糊精葡萄糖基转移酶产生菌的选育
[0019] 1)、产CGhse的菌株筛选：
[0020] 在碱性的琼脂培养基上添加0. 03% (w/v)酪献和0. 01% (w/v)甲基澄作为活性 筛选平板，将活化后的能够产淀粉水解酶的海洋微生物，稀释涂布于发酵复筛活性筛选平 板上，30°C观察培养60h。在产CG化Se的菌株形成黄色透明的水解圈。运是由于菌株所产 的CG化Se能够降解培养基中的可溶性淀粉形成环糊精，后者能够包埋甲基澄或酪献，使其 呈现黄色。此圈越大，菌株产的CG化Se越多，选取透明圈与菌落直径比值较大的单菌落，接 种到产酶培养基中进行摇瓶发酵复筛，测定其发酵液的a-CG化Se活力。从中筛选出酶活 较高者，利用亚硝基脈和利福平复合诱变筛选优良菌种，诱变后利用上述同样的方法进行 初筛和复筛，最终选取出酶活最高且遗传稳定的菌株112,作为后续诱变的出发菌株。
[0021] 2)、菌株Y112生长曲线： 阳02引配制14组液体种子培养基（250血小瓶装液量30血)，平行接种后在30°C环境下 培养2她，接种后每隔化，取一组测培养基的生物量。
[0023] W稀释后样品的OD值对培养时间作图，得菌株Y112生长曲线，由此可见，接种后 14-24h为对数增长期。
[0024] 3)、亚硝基脈（利福平）诱变：
[00巧]液体种子培养基（250mL小瓶装液量30mL)接种后培养至对数期。在无菌条件下， 将种子液转入无菌离屯、管中，4000g的离屯、力下离屯、lOmin，去除上清收集菌体。无菌条件 下，根据平板菌落计数法测定的结果加入适量缓冲液（pH9. 0, 0.Imol/L甘氨酸-NaOH缓 冲液）将菌悬液制成约1〇8个/mL,然后加入玻璃珠将细菌沉淀打匀；在无菌条件下，向细 菌悬浮液中加入不同剂量的亚硝基脈（或利福平），摇匀后盖上纱布，30°C，200r/min，培养 30min，60min。经亚硝基脈处理的菌悬浮液，W4000g的离屯、力离屯、lOmin，弃去上清液，再 加入憐酸缓冲液洗涂一次，并在同样条件下离屯、，弃去上清液。最后加入与处理时相同体积 的无菌生理盐水，再用无菌生理盐水进行适当稀释，涂布于平板上。30°C培养2d左右，计算 致死率。 阳0%] 采用亚硝基脈和利福平复合诱变筛选优良菌种，选取致死率为95 %的剂量处理对 数期的菌悬液，经过初筛和复筛，最终获得突变株Y112酶活最高，为出发菌株的1. 37倍。同 时，菌株Yl12在斜面培养基上连续接种4代，产酶