一种硅酸盐细菌培养基及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种培养基，特别设及一种用于娃酸盐细菌增菌培养的廉价培养基。 本发明属于微生物培养技术领域。
【背景技术】
[0002] 钟是农作物生长必需营养元素之一（QiokriHafsi,AhmedDebez,QiedlyAbdelly, 2014,Potassiumdeficiencyinplants:effectsandsignalingcascades[J].ActaPhy siologiaePlantarum, 36(5) : 1055-1070.)，在植物光合作用、碳水化合物的代谢、蛋白质合 成等过程均有参与，是促进农作物生长及影响其产量与品质的一个重要营养元素。（孙德 四，尹健美，陈哗，曹飞.钟矿物晶体结构对黑曲霉生长代谢及钟与娃的溶出影响[J]. 中国农业科学，2014, 03:503-513.)但在±壤中有95 %的钟为矿物钟的形态，大部分存在 于钟长石和云母之中，可供作物吸收利用的速效性钟不超过全钟2% (史静静，刘静洋，韩 国民，杨恩东，孙乐妮，唐欣构.棉花根际解钟细菌的生理活性和促生效果[J].中国± 壤与肥料，2012, 04:87-90.)，运导致了我国耕地普遍缺钟，在农业生产中对钟肥的需求量 一直居高不下。作为钟肥的消耗大国，我国钟肥消耗量约占全世界的14. 7%，但由于出产量 较小并不能满足国内需求，所W农业供给主要依靠国外进口。
[0003] 据相关研究表明娃酸盐细菌能够将存在于±壤中的固化无效钟转化为速效钟，若 能大面积推广应用，在解决农作物缺钟现象、降低进口成本、减轻使用化学肥料对环境的伤 害等方面将具有巨大的意义。但尽管娃酸盐细菌在生物肥料制备方面表现出了良好的潜 力，可是由于培养原材料成本过高，其在发酵生产过程中的价格将会是普通化肥的数倍，高 昂的价格成为了限制其推广与应用的重要原因。如何寻找一种廉价易得的发酵原料W降低 生产成本是解决运一问题的关键所在。
[0004] 我国畜禽养殖业在近些年来得到较大的发展，生产向规模化、标准化、产业化和 集约化转变的步伐逐步加快（林源，马撰，秦富.中国畜禽粪便资源结构分布及发展 展望[J].中国农学通报，2012,32:1-5.)。蓬勃发展的畜禽养殖业在为人们提供丰富食 品的同时其养殖中产生的粪污也对环境造成了极大的污染，如不妥善处置会造成±壤、 水质及空气等生态环境污染，并对动物及人类健康构成威胁（霍书豪，董仁杰，庞昌 乐，张万钦，崔凤杰，邹彬，钱静亚.畜牧业粪污减量与资源化利用的实现[J].中国 沼气，2014, 05:29-32巧1.)。但是粪污虽然是环境污染物，但其本身却含有丰富的营养 物质（RamasamyRajeshKum曰r,Bon邑JuP曰rk,JaeYoun邑Cho. 2013.Applicationand environmentalrisksoflivestockmanure[J].JournaloftheKoreanSocietyfor AppliedBiologicalQiemistry, 56巧）：497-503.)，可为微生物提供适宜的生长环境。合 理使用粪污既可作为发酵溫床生产有益微生物又可通过生物降解解决污染问题，不但使粪 污变废为宝，实现其剩余价值，还可节约大量用于治理环境污染的资源。 阳0化]鉴于此，本发明鸡粪"作为发酵底物通过响应面实验对娃酸盐细菌的发酵条件 进行研究，W期提供一种能够用于娃酸盐细菌增菌培养的廉价培养基，从而降低娃酸盐细 菌的生产成本并提高菌体生产量，为进一步降低微生物菌肥生产价格提供技术支持。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种能够用于娃酸盐细菌增菌培养的廉价培 养基及其制备方法和用途，该培养基W鸡粪作为培养基的碳氮源（发酵底物），粉碎賴杆作 为菌株吸附剂，在保证娃酸盐细菌生物量的同时能够实现降低发酵成本运一目的。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用了W下技术手段：
[0008] 本发明提供的一种娃酸盐细菌培养基，其特征在于所述培养基通过W下步骤制备 得到：
[0009] (1)称取鸡粪W及粉碎賴杆于容器中混合均匀，其中鸡粪与粉碎賴杆的重量比为 1-3:1 ；
[0010] 似使用淀粉调节步骤（1)混合物的碳氮比为19-31:l，WFe(0H)3为抑调理剂， Fe(OH)3的添加量为 0-2.0% (w/w);
[0011] (3)调节步骤（2)混合物的含水量为50-70% (w/w); 阳 01引（4)120。(：灭菌2〇-3〇111111，即得。
[0013] 在本发明中，优选的，所述鸡粪与粉碎賴杆的重量比为2:1。
[0014] 在本发明中，优选的，调节步骤（2)混合物的含水量为60% (w/w)。
[0015] 在本发明中，优选的，使用淀粉调节混合物碳氮比为19:1。
[0016] 在本发明中，优选的，Fe(OH)S的添加量为0.5% (w/w)。
[0017] 进一步的，本发明还提出了W上任一项所述的培养基在培养娃酸盐细菌中的应 用。
[0018] 更进一步的，本发明提出了一种培养娃酸盐细菌的方法，包括将娃酸盐细菌种子 液接种于W上任一项所述的培养基进行培养，培养时间为8-2她，培养溫度为20-40°C。
[0019] 在本发明中，优选的，所述的娃酸盐细菌为PlantibacterSP.WZW03,保藏在中国 典型培养物保藏中屯、，地址在武汉大学，其微生物保藏号是CCTCCN0.M2014569,保藏日期 为2014年11月18日。
[0020] 在本发明中，优选的，所述培养时间为20. 3化，培养溫度为29. 87°C。
[0021] 在本发明中，优选的，所述培养基中鸡粪与粉碎賴杆的重量比为2:1，使用淀粉调 节混合物碳氮比为19:l，Fe(0H)3的添加量为0. 5% (w/w)，调节混合物的含水量为60% (w/ W)O
[0022] 娃酸盐细菌PlantibacterSP.WZW03为本发明人从植物根系±壤中分离出一株 娃酸盐细菌，经研究发现其具有较强的解钟能力，可分泌吗I噪乙酸，施用后能明显增加西瓜 幼苗的地下部干重、须根数、根系长度等，且定植能力良好，对促进根系生长、优化根系结构 都有明显的作用。（该菌株已记载在申请号为201410798227. 5,发明名称为"分离获得的 放线菌属细菌WZW03菌株及其在缓解西瓜连作障碍方面的应用"的专利申请中。）但尽管 WZW03在生物肥料制备方面表现出了良好的潜力，可是由于培养原材料成本过高，其在发酵 生产过程中的价格将会是普通化肥的数倍，高昂的价格成为了限制其推广与应用的重要原 因。而本发明的提出为该菌的培养提供了一种廉价易得的发酵原料，极大的降低了生产成 本。
[0023] 本发明人W从植物的根际±壤中获得的具有植物促生功能的菌株娃酸盐细菌 PlantibacterSP.WZW03 (简称"WZW03")为待优化菌株，培养基采用低值发酵法，W20g鸡 粪作为培养基的碳氮源，IOg粉碎賴杆作为菌株吸附剂，于250mlS角瓶中混合均匀，使用 淀粉调节碳氮比为25:1，W化(OH)3为抑调理剂，添加量为1. 0% (w/w)，最后调节混合物 含水量到60% (w/w)，12(TC灭菌20-30min。而后将种子液按2% (v/v)的接种量接种于 培养基中，并W此培养基作为基础，研究鸡粪培养基的碳氮比，培养时间，培养溫度，抑调理 剂添加量四种因素对生物数量的影响。采用响应面分析法对培养基组成进行优化，W单因 素实验最佳水平区间作为基点对四种因素进行响应面实验设计，根据Box-Behnken的中屯、 组合设计原理，设定培养时间、培养溫度、碳氮比、抑调理剂四个因素作为自变量，W微生物 生长数量作为响应值，进行四因素立水平响应面分析实验，并通过Design-Exp&rt软件对 试验数据进行回归分析，确定鸡粪培养基最优配方。研究结果显示，经过单因素和响应面试 验后，最终确定培养基最终优化结果为：培养时间20. 3化、培养溫度29. 87°C、碳氮比19:1、 Fe(OH)S添加量0.5% (w/w)。W此优化条件进行发酵后，活菌数最大产量为1.47X109c化/ ml,经验证基本符合响应面预测值。由陈育如等人研究结果可知（陈育如，杨启银.解钟娃 酸盐细菌培养基及培养条件的研究[J].南京师大学报（自然科学版），2001,03:88-92.)， 其优化后的娃酸盐细菌培养基最大活菌产量为1. 06XIO9C化/ml,相比而言，本发明培养基 在活菌产量上提升了 33. 96%，具有较好的生物产量。为检验廉价培养基的优势性，本发明 对娃酸盐细菌在本发明的廉价培养基和普通培养基上的生长情况进行比较，结果显示，菌 株于优化后的廉价培养基上培养2化后，其活菌数达到最大值1. 47XIO9C化/ml,普通培养 基培养3化后达到最大活菌数达到6XIO7C化/ml,培养时间缩短12h，生物量提升了 24. 5 倍，按照市场价格计算，每生产1. 47Xl〇iic化，普通培养基花费为0. 1323元，而廉价培养基 只需0. 0145元，成本降低了 9. 12倍，大大节约了生产投入。
[0024] 综上所述，本发明提供了一种用于娃酸盐细菌培养的廉价培养基，同时利用响应 面法对廉价培养基的组成及对PlantibacterSP.WZW03菌株的培养条件进行优化，确定最 优配方组成为培养时间20. 3化、培养溫度29. 87°C、碳氮比19:UFe(OH)3添加量0. 5% (w/ W)，经验证后其最大生物产量为1. 47XIO9C化/ml，相较于WZW03菌株的普通培养基，本发明 的廉价培养基能明显提高菌体产量，缩短发酵周期，大幅降低生产成本，为生物菌肥产业化 应用提供重要参考数据。
【附图说明】 阳0巧]图1为单因素优化区间；
[0026] 图2为响应面立体分析图；
[0027] 图3为不同培养基生物量比较图。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着 描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技 术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可W对本发明技术方案的细节和形 式进行修改或替换，但运些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0029] 实施例I用于娃酸盐细菌培养的廉价培养基的优化及应用
[0030] 1材料与方法
[0031] 1. 1 菌种 W巧从植物的根际±壤中获得具有植物促生功能的娃酸盐细菌=Plantibacter SP.WZW03 (简称"WZW03 ")，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中屯、，地址在武汉大学，其微 生物保藏号是CCTCCNO.M2014569,保藏日期为2014年11月18日，该菌株已记载在申请 号为201410798227. 5,发明名称为"分离获得的放线菌属细菌WZW03菌株及其在缓解西瓜 连作障碍方面的应用"的专利申请中，由齐齐哈尔大学筛选并保藏。
[0033] 1. 2培养基 W34]LB液体培养基：蛋白腺10.OOg,酵母膏5.OOg,化Cl8.OOg,蒸馈水定容至 1000.OOml。
[0035] 细菌平板培养基：薦糖 0. 50g，CaC〇3 0.IOg,胞2册〇4 0. 50g，FeCls0. 05g，M拆〇4 0. 50g，钟长