树突状细胞抗原负载方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物肿瘤抗原与载体结合培养技术领域，具体设及一种树突状细胞抗 原负载方法。
【背景技术】
[0002] 树突状细胞值emlriticcell，DC)是人体内功能最强大的专职抗原呈递细胞，也 是唯一能刺激初始型T淋己细胞的抗原呈递细胞，能够诱导持久有力的特异性抗肿瘤免疫 反应。作为机体免疫应答的始动者，DC在肿瘤免疫、抗感染免疫、免疫排斥等方面的重要作 用已被深入研究。负载抗原的DC疫苗已成功应用于转移性前列腺癌、恶性黑色素瘤、多发 性骨髓瘤和慢性髓性白血病等肿瘤的治疗。
[0003] 树突状细胞与肿瘤的发生、发展具有密切关系：
[0004] 1.W肿瘤抗原体外专一性地冲击致敏、激活抗原呈递功能最强的树突状细胞，可 保证肿瘤抗原被有效摄取。 阳0化]2.树突状细胞通过细胞表面高水平的MHCI、II类分子呈递了丰富的肿瘤抗原 肤，使相应的T细胞受体（TCR)被充分占据；同时，树突状细胞提供高水平的协同刺激分子 B71(CD80)、B72(CD86)、CD40 等，使T胞被充分激活。
[0006] 3.树突状细胞与T细胞结合后，可W大量分泌IL-12,激发T细胞增殖，诱导CTL生成，主导了T化型的免疫应答，有利于肿瘤细胞的清除。 阳007] 4.树突状细胞还能分泌趋化因子值CCCK)专一性地趋化初始型T细胞，通过促进 T细胞聚集，增强对T细胞的激发。
[000引然而，人体内大部分DC处于未成熟状态，共刺激因子和粘附因子表达低水平较 低，体外激发同种混合淋己细胞增殖反应的能力较低，但未成熟DC具有较强的迁移能力和 极强的抗原吞隧能力，在摄取抗原（包括体外加工的抗原）或受到某些因素刺激时即分化 为成熟DC，而成熟的DC表达高水平的共刺激因子和粘附因子，抗原提呈能力较强，能有效 激活初始型T淋己细胞，诱导特异性的细胞毒性T淋己细胞（巧totoxicTlymphocyte， CTL)生成，启动抗肿瘤反应。
[0009] DC在血液中仅占单个核细胞总数的0. 5% -1. 0%，数量很少，因此，体外培养的DC 对于制备抗肿瘤的DC疫苗具有重要意义。目前DC疫苗的常规制备方法是将肿瘤抗原加入 底面铺满DC的培养瓶中，或者是将DC收集起来悬浮于离屯、管中再加入肿瘤抗原。前者需 要大量的肿瘤抗原；后者DC与肿瘤抗原的接触面积较低，影响了DC对肿瘤抗原的摄取量， 进而影响DC的抗原提呈效果。
【发明内容】
[0010] 为了解决DC疫苗制备过程中肿瘤抗原使用量大、DC与肿瘤抗原接触面积较低W致DC摄取肿瘤抗原的数量较低的问题，本发明设计一种树突状细胞抗原负载方法，实现节 约肿瘤抗原的使用量，并且增加DC与肿瘤抗原的接触面积，提高DC摄取肿瘤抗原的数量的 目的。
[0011] 实现上述目的技术方案是，本发明开发出的一种树突状细胞抗原负载方法，包括 如下步骤：获取树突状细胞，并将其与免疫磁珠结合后置于磁场中，再加入肿瘤抗原共培 养，得到负载上肿瘤抗原的树突状细胞。
[0012]在本发明提供的树突状细胞抗原负载方法中，所述免疫磁珠为携带有CD209单抗 的免疫磁珠。
[0013] 在本发明提供的树突状细胞抗原负载方法中，所述免疫磁珠的直径范围为 100-300nm。
[0014] 在本发明提供的树突状细胞抗原负载方法中，所述磁场强度小于或等于20mT。
[0015] 在本发明提供的树突状细胞抗原负载方法中，所述肿瘤抗原为结肠癌抗原、肝癌 抗原和肺癌抗原中任意一种。
[0016] 在本发明提供的树突状细胞抗原负载方法中，所述树突状细胞的来源为：从血液 中分离出单个核细胞，经体外诱导培养转化成树突状细胞。
[0017] 在本发明提供的树突状细胞抗原负载方法中，所述体外诱导培养的培养液为含体 积分数为1%PPP、浓度为50ng/mlGM-CSF、浓度为500IU/ml比-4的基础培养液。
[0018] 在本发明提供的树突状细胞抗原负载方法中，所述共培养步骤中还包括向所述已 负载肿瘤抗原的树突状细胞里加入TNF-a、白介素和脂多糖中的一种。
[0019] 在本发明提供的树突状细胞抗原负载方法中，所述TNF-a的浓度为1-lOng/ml、 或白介素的浓度为5-15ng/ml、或脂多糖的浓度为1-lOng/ml。
[0020] 实施本发明提供的树突状细胞抗原负载方法，可W达到W下有益效果：通过加入 免疫磁珠并置于磁场中，增加了树突状细胞与肿瘤抗原的接触面积，进一步促进树突状细 胞负载抗原的效率，并且节约了肿瘤抗原的使用量，提高树突状细胞的免疫活性。
【具体实施方式】
[0021] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用W解释本发明，并不用于限 定本发明。
[0022] 本发明提供的一种树突状细胞抗原负载方法，包括W下步骤：
[0023] 获取树突状细胞，并将其与免疫磁珠结合后置于磁场中，再加入肿瘤抗原共培养， 至树突状细胞负载肿瘤抗原，获得负载上肿瘤抗原的树突状细胞。
[0024] 本发明的改进点在于，将树突状细胞附着在免疫磁珠上，加入肿瘤抗原，置于磁场 中，通过免疫磁珠在磁场中的运动，增加树突状细胞与肿瘤抗原的接触面积，从而提高了肿 瘤抗原的负载量，缩短了肿瘤抗原的负载时间，提高了肿瘤抗原的负载效率，同时，也节约 了肿瘤抗原的使用量。 阳0巧]其中，免疫磁珠为携带有CD209单抗的CD209免疫磁珠，可W购买自德国美天旋生 物技术公司生产的CD209免疫磁珠，而树突状细胞表面也具有CD209单抗，因此，树突状细 胞能够与免疫磁珠进行结合，具体操作方法按美天旋公司CD209值C-SIGN)磁珠分选试剂 盒说明书进行操作；另外，优选地，免疫磁珠的直径范围为100-300皿，通过磁场的作用，能 够使树突状细胞与免疫磁珠充分结合均匀，便于提高后续肿瘤抗原的负载量W及缩短肿瘤 抗原的负载时间。由于磁场的强弱会直接影响树突状细胞的免疫活性，因此，本发明中优选 的磁场强度为小于或等于20mT，在保持树突状细胞活性的同时，也能够提高肿瘤抗原的负 载效率。
[00%]另外，为进一步提高树突状细胞的免疫活性，在树突状细胞与肿瘤抗原共培养 时，加入TNF-Q(肿瘤坏死因子-a)、白介素或脂多糖中的一种，培养24h收集得到的细 胞即可；其中，TNF-Q的浓度为1-lOng/ml、白介素的浓度为5-15ng/ml、脂多糖的浓度为 1-lOng/ml。在本发明优选实施例中，优先选用TNF-a，在增强树突状细胞免疫活性的同时， 能够进一步稳定树突状细胞的抗原提呈性。
[0027] 而本发明中的肿瘤抗原可W是结肠癌抗原、肝癌抗原、肺癌抗原中的任意一种，其 获取的具体方法步骤为现有技术，在此不再寶述。
[0028] 进一步地，本发明中树突状细胞可来源于人体血液，但由于树突状细胞在血液中 仅占单核细胞总数的0. 5-1. 0%，数量很少；因此，本发明优选实施例中，将单个核细胞通 过体外诱导培养方式，获取得到树突状细胞，具体步骤为：
[0029] 1)从血液中分离出单个核细胞；
[0030] 2)将得到的单个核细胞，用细胞培养液重悬细胞，静止放置2-化，吸去不贴壁细 胞悬液，获得分离后贴壁的单个核细胞；
[0031] 3)再加入体外诱导培养液培养72h，对步骤2)中获得的贴壁单个核细胞进行扩 增；
[0032] 4)用体外诱导培养液进行半量换液，并将步骤3)中扩增后的贴壁的单个核细胞 定向诱导转化成树突状细胞；
[0033] 其中，步骤1)从血液中分离出单个核细胞的具体过程为：
[0034] A、取100mL抗凝处理后的血液，将血液分别加入到4个50ml无菌离屯、管中； 300g离屯、lOmin，离屯、后，将所有的上层血浆转移到2个新的无菌离屯、管中，56 °C水浴灭 活30min，再于400g离屯、IOmin后，收集上层黄色液体即低血小板血浆（PoorPlatelet Plasma,PP巧，4°C储存备用。
[0035] B、向步骤A中4个下层含血细胞的离屯、管中加入注射用生理盐水，直到每管含 30ml混合液，并用移液器混匀。
[0036] C、再取4支含15ml淋己细胞分离液的50ml离屯、管，缓慢的将血细胞混合液用移 液器转移到淋己细胞分离液的上层；400g离屯、20分钟。
[0037] D、离屯、后将中间白膜层吸入到新的50ml离屯、管中；用注射用生理盐水补液到 45ml后，300g离屯、5分钟，清洗单个核细胞。
[0038] E、重新加入注射用生理盐水45ml，混匀后离屯、清洗单个核细胞。
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