一种检测抗除草剂草甘膦蛋白的单克隆抗体及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及农业生物技术领域，具体地，设及一种杂交瘤细胞株、一种单克隆抗体 及其在检测抗除草剂草甘麟蛋白中的用途。
【背景技术】
[0002] 20世纪80年代W来，转基因抗除草剂作物得到了大面积的推广与种植，开创了抗 除草剂作物发展的新局面。由于草甘麟除草剂具有广谱、无±壤残留及环境友好的特性，草 甘麟陆续在100多个国家注册，其用量与日俱增，成为世界上应用最广、产量最大的农药品 种，其年销售值一直居农药之首，全世界年销售值超过了 29. 3亿美元。但它作为一种非选 择性除草剂，对农作物同样有灭生性作用，运极大限制了草甘麟在农业生产中的应用范围。 美国孟山督公司通过向植物转入具草甘麟抗性的CP4-EPSPS基因，成功培育出了商业化的 转基因抗草甘麟作物，大大减少了田间杂草使用草甘麟的用量及除草费用，为草甘麟的应 用发展开辟了新的途径。目前已取得了一系列抗草甘麟作物，它们是：大豆、棉花、玉米、油 菜、甜菜、烟草、花生、小麦、向日葵、马铃馨、水稻、番茄、首猜、百脉根、黑麦草、杨树等，具有 我国自主知识产权的高抗草甘麟的5 -締醇丙酬酸莽草酸一3 -憐酸合成酶巧-enolpyru vylshikimate-3-phosphatesynthase,EPSP巧的转基因油菜、玉米、小麦和棉花已进入中 间实验阶段。随着转基因作物研发和商品化的快速发展，转基因作物释放可能带来的环境 安全问题引起了人们的高度重视。因此，建立和完善转基因成分的检测技术，尤其是我国比 较缺乏的转基因作物蛋白检测技术，既是转基因安全性评价的重要研究内容，也是基因工 程安全管理的重要技术保障；为促进我国转基因作物产业化开发提供有力的技术支撑，保 护我国人民健康，保护广大农民的利益和我国农业的持续健康发展具有重要意义。
[0003]G2-EPSPS蛋白编码基因克隆自草甘麟污染±壤细菌基因组文库，具有很高的草 甘麟耐受性。该基因编码的蛋白经分析属于ClassI类型，酶活测定显示该蛋白具有高底 物亲和能力和低草甘麟亲和力，因此能赋予宿主高草甘麟除草剂耐受力。在酶学水平上 G2-EPSPS基因草甘麟耐受性高于孟山都公司的CP4-EPSPS基因。
[0004]在转基因植物的研制开发或在对转基因产品进行筛选或安全性评价时，往往需要 对转入的外源性基因进行定性或半定量测定。运些定性或半定量测定的关键在于单克隆抗 体的使用，但是，目前已有的抗G2-EPSPS蛋白的单克隆抗体难W达到较高的敏感度和特异 性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种较高的敏感度和特异性的抗G2-EPSPS蛋白的单克隆抗 体。
[0006] 为了实现上述目的，一方面，一种杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株的保藏编号为 CGMCCNO. 10497。
[0007]再一方面，本发明还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO. 10497的杂交瘤细胞株产生。
[0008] 再一方面，本发明还提供了如上所述的单克隆抗体转G2-EPSPS基因农作物中的 用途。
[0009] 通过上述技术方案，本发明能够通过肥STERN化OT方法对G2-EPSPS蛋白进行检 ，并对CP4-EPSPS蛋白不呈现交叉反应，并且对5种不同来源的各种非G2-EPSPS转基因 作物也不呈现交叉反应。
[0010] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予W详细说明。
[0011] 生物材料保藏
[0012] 本发明的杂交瘤细胞株是本发明的发明人自行融合筛选得到的，其保藏编号为 CGMCCNO. 10497,保藏日期为2015年04月10日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中屯、，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究 所，分类命名为抗G2单克隆抗体杂交瘤细胞株。
【附图说明】
[0013] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0014] 图1是实施例2中单克隆抗体亲和层析纯化的结果图。
[0015] 图2是实施例2中单克隆抗体2KG3低倍稀释应用在WesternBlot检测里的结果 图。
[0016] 图3是实施例2中单克隆抗体2KG3高倍稀释应用在WesternBlot检测里的结果 图。
【具体实施方式】
[0017]W下结合附图对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0018] 一方面，一种杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCCNO. 10497。
[0019] 再一方面，本发明还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO. 10497的杂交瘤细胞株产生。
[0020] 其中，由保藏编号为CGMCCNO. 10497的杂交瘤细胞株产生单克隆抗体的方法可W 为本领域常规的方法，例如小鼠腹水法。
[0021] 再一方面，本发明还提供了如上所述的单克隆抗体转G2-EPSPS基因农作物中的 用途。
[0022] 其中，可W使用本领域常规的蛋白免疫检测方法将如上所述的单克隆抗体用于检 测转G2-EPSPS基因农作物。例如，可W从待检测的农作物中提取全蛋白，然后用免疫杂交 (WESTERNBLOT)的方法进行检测，如果出现G2-EPSPS的阳性条带，则指示待检测的农作物 为转G2-EPSPS基因农作物。
[0023]W下，通过实施例进一步详细说明本发明。W下实施例中，所用的试剂均为商购获 得。
[0024] 实施例1
[00巧]对取自草甘麟污染±壤样品提取细菌总DM,经电泳检测后来自2号样品（G2)的 总DNA质量较好。对G2细菌总DNA进行部分酶切（Sau3AI)，回收3-20化大小片段，同时 对PACYC184质粒进行BamHI酶切，然后进行连接反应。将连接产物转化aroA基因缺失大 肠杆菌ER2799,在M9培养基上筛选生长菌落。从生长菌落中提取质粒后进行测序鉴定，将 含有EPSPS编码基因aroA的质粒命名为pACe2g"^A。根据NCBIblast分析结果，找到一个长 1332bp编码444个氨基酸的aroA基因，根据G2-aroA(即G2-EPSP巧序列设计引物，在上游 引物5'端人工添加BamHI酶切序列，在下游引物5'端人工添加HindIII酶切序列。引物 合成、测序均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。具体所用引物序列如表1所示。
[0026] 表1
[0027]
[002引按照表2和表3所列的条件进行PCR反应。
[0029]表 2
[0030]
[00引]表3
[0032]
[003引按照表4所列的条件进行PCR产物与pGEM-T载体连接，并将连接产物转化大肠杆 -tt： 园O
[0034] 表 4
[0035]
[0036] 其中，连接和转化的条件包括：4°C过夜连接，连接产物转化入大肠杆菌巧.COli) JM109的感受态细胞中，涂布在加有Amp(50mg/血），IPTG(200mg/mL)和X-gal(20mg/mL)的 LB平板上进行重组转化的白色菌落筛选。质粒提取及酶切鉴定后送于诺赛生物公司测序鉴 定。
[0037] 按照表5和表6所列的条件，将测序检测正确插入目的片段基因序列的重组质粒 利用BamHI和HindIII限制性内切酶消化，连接到相应内切酶消化的表达载体祀T28a上， 构建成重组表达载体。
[0038] 表 5
[0039]
[0040] 表 6
[0041]
[004引经过限制性内切酶消化的重组质粒和载体片段利用QXIIDNA纯化回收试剂盒(QIAEXIIDNAGelExtractionKit)经过凝胶电泳进行目的片段回收，回收方法包括：（1) 将目的条带从0. 5 %的琼脂糖凝胶上切下，称量其重量；（2)加入3倍体积的QXIBuffer 和2倍体积的灭菌的超纯水和5y1的QXII悬浮液；（3) 50°C水浴lOmin，直至胶全部溶解； (4)W最大速度离屯、0. 5min，弃上清；（5)沉淀重悬于500yL的QXIBuffer,W最大速度离 屯、0. 5min，弃上清；（6)沉淀重悬于500JiL的阳Buffer,W最大速度离屯、0. 5min，弃上清； (7)沉淀干燥后加入30yL的(1地20 ; (8) 50°C水浴