一种真菌来源的酸性纤维素酶及其基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域。具体地，本发明设及一种来源于真菌的酸性纤维素酶 及其基因和应用。
【背景技术】
[0002] 植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素及木质素等物质构成。纤维素是一种重要的 多糖，它是植物细胞支撑物质的材料，是自然界最丰富的生物质资源，纤维素的结构确定 为P-D-葡萄糖单元经0 - (1 - 4)糖巧键连接而成的直链多聚体，结构中没有分支，其 能够被纤维素酶降解为葡萄糖。
[0003] 纤维素酶是指能够水解葡萄糖巧键，将纤维素分解成纤维二糖和葡萄糖的一组酶 的总称。其对纤维素的水解过程主要包括=步：第一步是内切型纤维素酶作用于纤维素内 部的无定形区，随即水解0 - (1-4)糖巧键将纤维素分子截短，随后外切型纤维素酶，作 用于纤维素线状分子末端，水解P- (1-4)糖巧键，每次切下一个纤维二糖分子，最后， 葡萄糖巧酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。
[0004] 近年来，随着绿色饲料的兴起W及人们环保意识的增强，能源的再生利用研究，人 们对纤维素酶的研究和利用已进入了一个新的阶段。纤维素酶已被广泛应用于食品、医药、 饲料、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域，是一种新型的工业酶， 具有很大的潜在应用价值。
[0005] 纤维素酶广泛存在于细菌、放线菌、真菌、植物、动物等生物中。不同的微生物产生 的纤维素酶，其结构和功能差异较大，纤维素酶按作用的最适抑不同可分为：酸性纤维素 酶（最适抑约为4.8)，它是目前研究较多和应用最广泛的纤维素酶，主要由康氏木霉，里氏 木霉，绿色木霉，黑曲霉，青霉等产生；中性纤维素酶（最适P册-8,），主要由长梗木霉，腐殖 菌，芽抱杆菌等产生；碱性纤维素酶（最适P册-11)，主要由嗜热芽抱杆菌，腐殖菌等产生。 自然界中存在的纤维素资源来源复杂，其结构和功能差异较大，不同来源的纤维素酶对它 们的降解效果也不尽相同，针对不同来源的纤维素寻找降解效果较高的纤维素酶，是当前 纤维素酶领域的热点之一。目前国内外，虽然许多纤维素酶被克隆分离及性质测定，但运些 酶的性质特征，均存在一些缺陷，例如，抑作用范围不合适，热稳定性差，表达量低等，均不 能满足实际应用的需要。因此人们希望能够找到新的能够满足实际应用需求的纤维素酶， 从而能够进一步推广纤维素酶在饲料、食品、医药等行业中应用。
[0006] 本发明从ProstheciumopalusCBS125034菌株中得到了一个新的纤维素酶基 因，其编码的纤维素酶具有W下几个优点：酸性、广泛的底物特异性、容易发酵生产。所有运 些优点都意味着新发明的纤维素酶在饲料、食品、医药等行业中，将会比一千报道的纤维素 酶更有应用价值。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种酸性、底物特异性比较广泛的纤维素酶。
[0008] 本发明的再一目的是提供上述纤维素酶的基因。
[0009] 本发明的再一目的是提供包含上述纤维素酶的重组载体。
[0010] 本发明的再一目的是提供包含上述纤维素酶基因的重组菌株。
[0011] 本发明的再一目的是提供一种制备纤维素酶的方法。
[0012] 本发明的再一目的是提供上述纤维素酶的应用。
[0013] 本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、 适合于在饲料、食品、医药等行业中应用的新的纤维素酶，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1 :
[0014] 別FTWYDLSSIDKFMAQGV畑FRLNFLME化TPNNLTAPLDPLYLGNLTEQV101NYITAKGAYAMIQPHNYGRFMGEIITDTAGFKTWKNVAAEYKDNDLVVF 巧1DTNNEYHDMDQKLVTDLNQAAIDGVREAGATKQYITPEGNSWTGAWT保VS 201SGNAA化VAL邸巧NKLIYQM明YLDVDGSGTHAECVSATVFR邸LVAAT 251QWLKANNKQGVIGGFAAGVNEQCVAALQDGLAYLAENGDV\WGAMWAAG 301 鞠带谢YMYSMEP盼GPAWVGILPKI盼YFV*
[0015] 其中，该酶全长330个氨基酸，N端19个氨基酸为信号肤序列 "MFFSKLAVSIAALASSATA"。
[0016] 因此，成熟的纤维素酶Cel5的理论分子量为35kDa，其氨基酸序列如SEQID NO. 2 ：
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[0019] 该纤维素酶的最适抑为5. 0,在抑4. 5-P册.0范围内，该酶能够维持其70%W上 的酶活力；最适溫度60°C，在70°C时依然具有50%W上的酶活力，在50°C下处理60min，剩 余酶活在80%W上，在60°C下处理20min，依然能够保持37%的酶活力，具有良好的稳定 性。
[0020] 本发明还提供了编码上述纤维素酶的基因。该酶的全基因序列如SEQIDNO. 3所 示：
[0021] I ATGTTCTTCA GCAAACTCGC TGTTTCTATC GCGGCGCTAG CCTCGTCAGC TACGGCGCAA 61 AACTCGACCA AGAAGCTGAA ATGGTT说GC ATCAATGAGT说GG说CTGA GTTTGGCGAG 121 AAGAACTTCA CGGGTGTGTA TGGCAAGGAG TTCACAT说T ACGATCTCTC CAGCATCGAC 181 AAATTCATGG CCCAAGGCGT CAACCACTTC CGTCTCAACT TCCGTAAGTT ATGCCACCCG 241 TCTACGTAAA CACCCACCAT AGGACTCCCA AACCTAACGT GACGACCAAC AGTAATGGAA 301 CGCCTCACCC CCAACAACCT CACCGCCCCC CTCGACCCAC TCTACCTCGG CAATCTCACC 361 GAGCAAGTTA ACTATATAAC CGCAMAGGC GCCTACGCCA TGATCCAACC GCACAACTAC 421 GGCCGCTTCA TGGG说AAAT CATCACCGAC ACAGCCGGCT TCAMACATG GTGGAAGAAC 4別GTAGCCGCAG AGTACAAAGA CAACGACCTC CTCGTCTTCG ACACAAACM CGAATACCAC 541 GACATGGATC AGAAACTCGT GTTTGATCTC AACCAAGCCG CCATCGACGG CGTACGCGAG 601 GCAGGCGCAA CGAAGCAATA CATCACCCCT GAGGGGAACT CGTGGACGGG CGCTTGGACG 6日1 TGGGTAAGCA G说GTAACGC CGCCAGTCTC GTCGCCCTCA AAGACCCCTC GAACAAACTG 721 ATCTACCAAA TGCATCAATA CCTCGATGTA GAC说CAGCG GTACGCACGC TGAATGCGTT 781 TCCG说AC说TTTTC饼CGA GA说灯KTG GCGGCTA说C AGTGGCTCAA GG说AATAAC 841 AAGCAAGGTG TTATTGGCGA GTTTGCTGCC朋CGTGMTG AGCAGTGTGT GGCCGCGTTG 901 CAGGATGGGT TGGCCTATTT GGCGGAGAAT GGGGATGTGT GGTGGGGCGC TATGTGGTGG 961 GCTGCTGGGC CTTGGTGGGG GGATTATATG TATAGTATGG AGCCTGAGAG TGGGCCGGCT 1021 TGGGTGGGGA TTTTGCCGAA GATTAAGTCG TATTTTGTGT AA
[0022] 本发明通过PCR的方法分离克隆了运个纤维素酶基因Cel5, DNA全序列分析结果 表明，纤维素酶Cel5结构基因全长1062bp，含有1个内含子，巧24~292bp为其内含子序 列，cDNA长993bp，其cDNA序列如沈Q ID NO. 4所示：
[0023] I ATGTTCTTCA GCAAACTCGC TGTTTCTATC GCGGCGCTAG CCTCGTCAGC TACGGCGCAA 61 AACTCGACCA AGAAGCTGM ATGGTTCGGC ATCAATGAGT CGGGCGCTGA (}TTTGGCGAG 121 AAGAACTTCA CGGGTGTGTA TGGCAAGGAG TTCACATGGT A说AT灯CTC CAGCATCGAC 181 AAATTCAT说CCCAAGGCGT CAACCACTTC CGTCTCAACT TCCTAATGGA ACGCXTCACC 241