Ac016745.3作为前列腺癌分子靶标及其在诊断试剂盒中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种前列腺癌分子祀标AC016745. 3及其在 诊断试剂盒中的应用，包括通过该生物分子祀标在前列腺癌高危人群的筛选、前列腺癌的 诊断、前列腺癌治疗及状况的监测、前列腺癌指导用药的监测及前列腺癌预后检测等领域 的应用。
【背景技术】
[0002] 根据《ASC0年度报告：2015临床肿瘤学进展》中相关内容，液体活检技术被 列为肿瘤治疗领域下一个十年趋势之一。血液中的一些分子标志物已经被应用于一些 疾病的诊断，如谷丙转氨酶用于肝炎的诊断，白细胞数目用于判断炎症。血液循环肿瘤 DNA(circulatingtumorDNA，CtDNA)是一种无细胞状态的胞外游离DNA，存在于血液、滑膜 液和脑脊液等体液中，体细胞DNA经脱落或者当细胞调亡后释放进入循环系统，其主要是 由短的单链或双链DNAW及单链与双链DNA的混合物组成，WDNA蛋白质复合物或游离DNA 两种形式存在。CtDNA来自肿瘤细胞的体细胞突变，因此，CtDNA是一种特征性的新的肿瘤 生物标记物，并且还可W被定性、定量和追踪，将成为临床肿瘤的早期诊断、预后判定及跟 踪随访等提供一系列方便、快捷、特异、无创或微创和分子生物学检测手段，尤其对于一些 不具有典型临床症状、检查无特异性和诊断困难的肿瘤可避免复杂的、具有创伤性的活检。 结合新一代测序技术（NG巧将变成"液体活检"，并替代侵入组织性活检。
[0003] AC016745. 3 属于IncRNA(Ion即on-codingRNA，长链非编码RNA)，是一类转录本 长度超过200个核巧酸的非编码RNA，近年研究发现它是一类具有重要生物学功能的RNA, 参与基因组印记、染色体沉默、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调 控过程，在细胞分化和发育、基因转录和翻译、遗传和表观遗传等生命活动中均发挥重要的 调控作用。近年来，越来越多的权威研究证实IncRNA在肿瘤的发生发展中起着抑制或促进 肿瘤的作用，在调控肿瘤细胞增殖、调亡、细胞周期、侵袭转移能力等方面，均具有十分重要 作用。目前己有较多IncRNAs被证实在包括乳腺癌、前列腺、黑色素瘤、肝癌、结肠癌、膀脫 癌等在内的人类多种肿瘤中存在差异表达并执行重要的调控功能。早期有效检测肿瘤的发 生、发展及提高抗癌药物的疗效对于癌症的治疗尤为重要，发明新型肿瘤标志物作为诊断 与治疗的祀点一直是肿瘤研究的热点。
[0004] 前列腺癌是常见的男性生殖系统恶性肿瘤之一。世界范围内，前列腺癌发病率在 男性所有恶性肿瘤中位居第二，在美国前列腺癌的发病率已经超过肺癌，成为第一位危害 男性健康的肿瘤。亚洲前列腺癌的发病率远远低于欧美国家，但近年来呈现上升趋势，且增 长比欧美发达国家更加迅速。前列腺癌患者主要是老年男性，一般在50岁W后发病，95%发 生于60岁W上的老年男性，发生率持续地随着年龄增长而增加。前列腺癌早期多无任何症 状，即使有所不适，也不足W引起病人的重视，当肿瘤增大压迫尿道时，又往往与前列腺增 生相混淆。在我国约80%的病人首先发现远处转移病灶才发现前列腺癌。此时，病变已达 晚期，预后不良。 阳0化]前列腺癌的临床诊断方式目前主要有直肠指检、血清前列腺特异性抗原（PSA)检 、直肠超声波检测、活组织病理检查等。直肠指检是最简单、最经济实用的方法，主要通过 医生的食指触摸前列腺，用W发现很多无症状的前列腺癌患者，有可能获得早期诊断及根 治的机会。但W上的方法都存在局限性。例如直肠指检的局限性主要在4个方面：（1)患者 前列腺肿块不大时，易漏诊；（2)部分患者前列腺癌肿大不明显，但已属于晚期，不易根治； (3)患者直肠有疾患时不能使用此检测；（4)医生经验不足时可能有漏诊或者误诊的可能。 正常情况下血液中的PSA不高(不高于4ng/ml),当处于前列腺癌及其他前列腺疾病患病 状态时，PSA升高成为目前筛查前列腺癌最敏感的瘤标，但其也存在一定局限性：（1)需要 取血检测，对患者有一定的损伤；（2)PSA增高也常见与非前列腺癌疾病，如前列腺炎症、前 列腺肥大等，因此不易确诊；（3)PSA增高确诊前列腺癌时，往往患者已经属于中后期，达不 到早期诊断的目的。前列腺超声波检测操作简单直观、无损伤，通过显示肿块的大小、数目、 位置、密度、边缘、形体、有无巧化及巧化的形态、大小、数目、分布W及周围的晕环、皮肤改 变等提供定位及定性征象并判断病变的性质；其局限性是：（1)对致密性的小癌灶容易漏 诊；（2)有时候不能提供明确的定性诊断；（3)因其不能显示肿瘤的内部结构及周围组织所 W诊断符合率很低；（4)对一些缺乏典型征象的实性良恶性肿块有较高的误诊率。活组织 病理检查因其创伤性、复杂性不能作为初筛的手段，但它是前列腺癌确诊的金标准，一般与 其他方法技术连用。
[0006] 近年来的研究表明，IncRNA与前列腺癌密切相关，它们可能参与肿瘤的发生、发展 和转移，所W对肿瘤的发病机制、早期诊断、个体化治疗、转移的检测和预后等可能有相应 的作用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种与前列腺癌相关的新的前列腺癌分子祀标，W及前列 腺癌诊断试剂盒，W及该前列腺癌分子祀标和前列腺癌诊断试剂盒在前列腺癌高危人群筛 选、诊断、治疗及状况监测、预后监测中的应用。
[0008] 本发明经研究发现AC016745. 3在前列腺癌组织样本中的含量比前列腺正常组织 样本中的含量高，显示AC016745. 3与前列腺癌的肿瘤发生、发展存在着密切的相关性。因 此，本发明提出AC016745. 3作为与前列腺癌相关的新的前列腺癌分子祀标，并提供含有该 前列腺癌分子祀标AC016745. 3 (作为标志物）的诊断试剂盒，W及该分子祀标或诊断试剂 盒在前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗及状况监测、预后监测中的应用。
[0009] 本发明提供的前列腺癌分子祀标AC016745. 3,是一种IncRNA，全长508bp，其核巧 酸序列为SEQIDNO. 1所示。
[0010] 前述的前列腺癌分子祀标AC016745. 3,可用于筛选预防、缓解和/或治疗前列腺 癌的药物。其抑制剂AC016745. 3SiRNA(SEQIDNO. 6、SEQIDNO. 7)可用于制备预防、缓 解和/或治疗前列腺癌的药物。
[0011] 本发明还提供含有前述前列腺癌分子祀标AC016745. 3的诊断试剂盒。该诊断试 剂盒可用于前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测等。
[0012] 前述的前列腺癌分子祀标AC016745. 3作为标志物在制备前列腺癌高危人群筛 选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用，是通过检测被试者组织样本、血液和 尿液中的AC016745. 3的含量，并与正常水平AC016745. 3含量相比较，W进行前列腺癌高危 人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测。
[0013] 前述的前列腺癌分子祀标AC016745. 3作为标志物在制备前列腺癌高危人群筛 选、诊断、药物设计、治疗及状况监测、预后监测的试剂盒中及药物中的应用，可把被试者血 清、尿液和组织样本中AC016745. 3的含量通过总RNA提取、反转录、定量PCR进行检测。
[0014] 前述的诊断前列腺癌的诊断试剂盒包括： (1) 组织样本、血液和尿液中总RNA提取试剂； 每50mg组织或200ul血液或200ul尿液，使用：
(2) 反转录试剂；
(3) 定量PCR试剂；
引物包括AC016745. 3和对照0 -ACTIN两对引物； (4) 前列腺正常组织CDNA 作为阴性对照与检测样本CDNA共同定量PCR检测，每个反应体系使用与检测样本CDNA相同量。
[0015] 前述的诊断前列腺癌的诊断试剂盒结果分析检测样本和阴性对照间比较采用t 检验，P<0. 05为差异显著，判为标本检测阳性。
[0016] 前述检测试剂盒所用对照为0 -ACTIN，其引物序列如下： 0-ACTIN上游引物序列：5 ' -CCTCTCCCAAGTCCACACAG-3 '(沈QIDNO. 2) 0-ACTIN下游引物序列：5 ' -GGGCACGAAGGCTCATCATT-3 '(沈QIDNO. 3)。
[0017] 前述检测试剂盒所检测AC016745. 3,其引物序列如下： AC016745. 3 上游引物序列：5 ' -GGTGACGAAAATTCTACATTGCT-3 '(沈QIDNO. 4)AC016745. 3 下游引物序列：5 ' -ACCTGGCTGGTGTCCTCTG-3 '(沈QIDNO. 5)。
[0018] 本发明为前列腺癌的诊断和治疗提供了一种新的分子祀标AC016745. 3。该分子 祀标的抑制剂可用于制备治疗前列腺癌的药物，同时可作为标志物应用于制备诊断试剂盒 中。使用该分子祀标及含有该分子祀标的诊断试剂盒诊断前列腺癌，操作简单、取材方便、 安全无创伤，且具有较高的特异性、灵敏性和方便大量筛查的特点。该分子祀标适合应用于 前列腺癌高危人群的筛选、前列腺癌的鉴定、前列腺癌治疗及状况的监测、前列腺癌指导用 药的监测和前列腺癌预后监测等领域。
【附图说明】
[0019] 图1.AC016745. 3在前列腺癌组织样本中和正常组织样本中的含量检测。
[0020] 图2.前列腺癌PC-3细胞系中AC016745. 3siRNA对AC016745. 3沉默效率。
[0021] 图3. AC016745. 3-siRNA显著抑制前列腺癌细胞的增殖。 阳02引图4.药物SB20580显著抑制前列腺癌细胞系中ACO16745. 3的表达。
【具体实施方式】
[0023] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但下述实施 例仅用于说明本发明而不限制本发明的范围，下面实施例中未提及的具体实验方法，按照 常规实验方法进行。
[0024] 实施例1:AC016745. 3在前列腺癌组织样本中和正常组织样本中的含量检测 本实施例主要步骤如下： 1、组织样本中总RNA的提取 获得前列腺癌根治术患者手术后的组织样本，同时获得淋己结清扫术的患者切除的组 织样本作为对照。提取前述组织样本的总RNA于无DNA和无RNA酶污染的1. 5毫升离屯、管 中。
[00巧]组织样本中提取总RNA的试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。提取的总RNA通过使用化ermNanoDrop2000c分光光度计，测定260/280nm紫外波长的比值进行的浓 度测定。 阳0%] 2、定量检测组织样本中的IncRNA (O反转录RNA得到cDNA单链 按照下表1配置反转录体系，配置过程在冰上进行。配置好的体系在PCR仪上进行反 转录。反应条件为38摄氏度15分钟，85摄氏度5秒。 W別表1
表1中X表示加入的RNA体