一种利用重组大肠杆菌制备鸡白介素2的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，具体设及一种利用重组大肠杆菌制备鸡白介素2 的方法。
【背景技术】
[000引 白细胞介素-2 (interle址in2,比-2)是T细胞和自然杀伤性细胞（NK细胞）产 生的糖蛋白，是动物体内一类重要的细胞因子，具有激活淋己因子活化的杀伤细胞和自然 杀伤细胞，刺激T辅佐细胞和自然杀伤细胞产生细胞因子和促进细胞因子的繁殖，在机体 的免疫应答中起重要作用。
[0003] 人和许多哺乳动物IL-2的研究发展很快，已广泛应用于各种疾病的治疗和疫苗 免疫，而鸡比-2研究发展相对较慢，1997年，Sundick和Gill-Dixon通过构建CDNA文库 的方法，首次从ConA活化的T淋己细胞中获得了鸡的比-2cDNA，为鸡比-2的研究打开了 局面。之后，国内的众多研究者则相继克隆出了固始鸡、萧山鸡、白羽乌骨鸡等十多个地方 品种鸡的IL-2基因。目前，已实现了鸡IL-2基因借助大肠杆菌、酵母或真核细胞进行表 达。在W上表达方式中，利用大肠杆菌作为表达载体稳定性较高、工艺易于控制，应用最为 广泛，然而由于鸡白介素2表达基因存在较多的大肠杆菌稀有密码子，因此影响了产率。
[0004] 针对此问题，诸多研究者尝试通过基因改造对表达体系进行改良，并取得了突出 的成果，其中本申请人通过替换鸡白介素2天然表达基因中的大肠杆菌稀有密码子使得重 组大肠杆菌对鸡白介素2的表达得到了显著的提升（CN104561021A)，然而由于基因重组后 大肠杆菌与野生型相比其生理特性发生了变化，因此如果继续沿用野生型菌株的培养条件 往往不能有效表达鸡白介素2蛋白；此外，应当针对鸡白介素2表达基因的特性匹配适宜的 表达条件，从而提升重组大肠杆菌对鸡白介素2的表达效率。而且，对于表达产物的后续纯 化也需要根据基因工程菌的特性、蛋白的特性进行具体设计。在上述技术问题层面，由于需 要针对具体情况进行适应性研究，因此现有技术中尚缺乏一种针对性且高效的利用重组大 肠杆菌制备鸡白介素2的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种鸡白介素2表达基因改造方法、 利用该方法改造得到的基因，W解决现有技术中利用重组大肠杆菌表达鸡白介素2产率较 低的技术问题。
[0006] 本发明解决的另一技术问题是提升W重组大肠杆菌所表达的鸡白介素2蛋白的 纯化效率。
[0007] 为实现W上技术目的，本发明采用W下技术方案：
[0008] -种利用重组大肠杆菌制备鸡白介素2的方法，包括W下步骤：
[0009] 1)W异丙基-0 -D-硫代化喃半乳糖巧为诱导物对重组大肠杆菌进行诱导表达， 诱导浓度为0. 8~1.Ommol/l，诱导溫度为30~37°C，诱导表达时间为4~6小时；
[0010] 2)取步骤I)诱导表达后的菌体，裂解获得包涵体，加入变性缓冲液溶解变性，而 后再加入复性缓冲液进行稀释复性；
[0011] 3)取步骤2)复性后的蛋白执行层析纯化。
[0012] 优选的，步骤2)所述变性缓冲液包括W下成分：45~55mMTris-肥1，7~9M 化ea，8~12mMDTT，0. 8~1. 2mM邸TA。在此基础上可W进一步分别执行W下优选：调整 所述变性缓冲液抑至7. 8~8. 2 ;变性缓冲液的加入量为8~12mL/g包涵体；变性条件为 在2~6°C条件下变性22~26h。
[0013] 优选的，步骤2)变性后，离屯、收集上清而后再向上清液中加入复性缓冲液复性。
[0014] 优选的，步骤2)所述复性缓冲液包括W下成分：17~23mMTris-HCl, 1. 8~2. 2M 化ea，0. 8~1. 2mM脫氨酸，2. 8~3. 2mM半脫氨酸；在此基础上可W进一步分别执行W下优 选：调整所述复性缓冲液抑至7. 8~8. 2 ;复性缓冲液的加入量满足W下条件：加入复性缓 冲液总量后，溶液中蛋白浓度为0. 08~0. 12mg/mL;复性条件为：在2~6°C、揽拌条件下， 加入所述复性缓冲液，复性22~26h，其中揽拌转速可W优选为200~30化pm，而加入方式 可W优选为非一次性的加入，例如可W是分若干次加入。
[0015] 优选的，复性后离屯、收集上清，对上清执行层析纯化。
[0016] 优选的，步骤3)所述层析为阴离子交换层析，上样后、洗脱目的蛋白之前，先W 1. 8~2. 2倍柱体积的含有0. 04~0. 06M化Cl、18~22mMTris-肥1的溶液洗脱杂蛋白， 该溶液抑可W优选为7. 8~8. 2 ;在此基础上可W进一步分别执行W下优选：所用层析填 料为QSe地arose化StFlow;用于洗脱目的蛋白的溶液包括W下成分：0.4~0.6M化Cl, 18~22mM化is-肥1，所述用于洗脱目的蛋白的溶液其抑可W优选为7. 8~8. 2。
[0017] 优选的，所述重组大肠杆菌的鸡白介素2表达基因W地V220、pET系列载体或P犯 系列载体的任一种作为表达载体，进一步优选为祀T-28a(+)表达载体。
[0018]优选的，所述重组大肠杆菌的菌种为大肠杆菌D册a、大肠杆菌化21值63)或大肠 杆菌JM109。
[0019] 在W上任一技术方案基础上优选的，所述重组大肠杆菌中的鸡白介素2表达基因 是在鸡白介素2天然表达基因的基础上W大肠杆菌非稀有密码子替换其中的大肠杆菌稀 有密码子，所得到的基因。
[0020] 进一步优选的，其特征在于所述鸡白介素2表达基因，在其所表达的蛋白质N端对 应的核巧酸上连接有信号肤或利用表达载体上的信号肤，所述信号肤为pelB或ompT的其 中一种、为祀T表达载体所带、位于多克隆位点N端。
[0021] 进一步优选的，所述鸡白介素2表达基因，在其末端具有标签蛋白，所述标签蛋白 为His标签、Arg标签、FLAG标签或GST标签的其中一种。
[0022] 进一步优选的，所述鸡白介素2表达基因的序列如SEQIDN02所示。
[0023]本发明所述的重组大肠杆菌专指已经整合有鸡白介素2表达基因的基因重组大 肠杆菌；上述鸡白介素2表达基因既可W是天然基因序列也可W是适当改良的、不影响 所表达蛋白的核巧酸序列的人工基因序列；上述"整合有"是指该基因能够在该重组大肠 杆菌中顺利表达，可W但不限于存在于质粒上或核区基因上。W上技术方案中所述的Q Se地aroseFastFlow层析填料是一种商品名，具体限定为由美国GE公司出品的型号为Q Se地aroseFastFlow的层析填料。在W上技术方案中，单位"M"和"ml"分别指"mol/L" 和"mmol/L"，化ea指尿素，DTT是指二硫苏糖醇。
[0024] 本发明提供的方法及基因专口针对原核表达系统，尤其是W大肠杆菌为宿主的表 达系统，因此本发明的基因改造方法是在鸡白介素2天然表达基因的基础上将其中大肠杆 菌的稀有密码子替换为非稀有密码子，从而提升了大肠杆菌对鸡白介素2及其衍生蛋白的 表达效率。在此基础上，本发明通过对鸡白介素2表达基因密码子的取代、添加或缺失实现 了改造后基因所表达的蛋白具有鸡白介素2的生物活性。
[002引本发明提供的序列如SEQIDN02所示的基因与鸡白介素2天然表达基因的核巧 酸数量均为366个，所表达的蛋白其氨基酸序列相同。利用该基因所表达的鸡白介素2蛋 白虽在大肠杆菌中W包涵体的形式表达，但较高的表达量及后续的简易复性、纯化工艺，弥 补了运一劣势，具有产量、复兴率及回收率高的优点，且生产周期短，成本低，为鸡白介素2 的规模化生产奠定了良好的基础。本发明针对该表达系统的自身特性匹配了特定的工艺条 件，通过对蛋白变性、复性W及纯化方法的创新设计使得利用该方法能够高效的表达鸡白 介素2并能获得高纯度蛋白，具有突出的技术优势。
【附图说明】
[0026] 图1是鸡白介素2天然表达基因（化IL-2-脚序列与本发明SEQIDN02序列 (ChIL-2-O)对比图；
[0027] 图2是琼脂糖凝胶电泳检测化IL-2-0基因的PCR扩增结果，其中M为Marker,Ll 为PCR产物电泳结果，L2为阴性对照。
[0028] 图3是SDS-PAGE检测诱导后与未经诱导的化IL-2蛋白在大肠杆菌中的表达结 果，其中M为非预染蛋白Marker。
[0029] 图4是SDS-PAGE检测化IL-2蛋白的变复性结果，其中M为非预染蛋白Marker。
[0030] 图5是SDS-PAGE检测化IL-2蛋白的离子交换层析结果，其中M为非预染蛋白 Marker,Ll为上样流穿液，L2为平衡缓冲液洗涂的杂蛋白，L3为洗脱缓冲液洗脱的蛋白，L4 为清洗柱子的洗脱物。
[0031] 图6是化IL-2蛋白促鸡外周血T淋己细胞增殖的活性检测结果。
【具体实施方式】
[0032] W下将对本发明的【具体实施方式】进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在 W下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
[0033] W下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情 况下可允许数量有一定的变动。因此，用"大约"、"左右"等语言所修正的数值不限于该准 确数值本身。在一些实施例中，"大约"表示允许其修正的数值在正负百分之十（10%)的 范围内变化，比如，"大约100"表示的可W是90到110之间的任何数值。此外，在"大约第 一数值到第二数值"的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近 似性语言可能与测量仪器的精度有关。
[0034] 除有定义外，W下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人 员普遍理解的相同含义。
[0035] W下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验 方法，如无特