L-天门冬氨酸-l-鸟氨酸的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种有两个氨基酸的已知序列的制备技术领域。
【背景技术】
[0002] k天口冬氨酸-k鸟氨酸，化学名为（S)-2-氨基下二酸-(巧-2, 5-二氨基戊酸 盐，分子式为CgHigNsOe,分子量为265. 26,结构式为：
k天口冬氨酸-k鸟氨酸主要用于治疗肝性脑病及急、慢性肝病巧日各型肝炎、肝硬 化、脂肪肝、肝炎后综合症）引发的血氨升高，如伴发或继发于肝脏解毒功能受损或发作期 肝性脑病，尤其适用于治疗肝昏迷早期或肝昏迷期的意识模糊状态。
[0003] 现有的k天口冬氨酸-k鸟氨酸的制备方法中，k鸟氨酸多W盐酸盐、硫酸盐、 醋酸盐的形式存在，如何去除k鸟氨酸中的盐成为影响其制备工艺的技术关键。
[0004] 文献GB965637、GB1067742、EP477991公开的k天口冬氨酸-k鸟氨酸的制备方 法中，重要通过阳离子交换树脂来处理k鸟氨酸盐，W得到游离的k鸟氨酸，再与k天口 冬氨酸反应，制得k天口冬氨酸-k鸟氨酸。该方法的缺点是：产品收率低(约50%)，且需 要耗费大量的树脂，而树脂再生过程中需要消耗大量的水，并生产大量待处理且算是困难 的酸水，=废产生量大，成本偏高，难W实现工业化生产。
[0005] CN101100435A公开了一种k天口冬氨酸-k鸟氨酸的制备方法，将k鸟氨酸硫 酸盐溶于蒸馈水中，加入k天口冬氨酸，加热溶解后用氨氧化领中和硫酸，过滤，再用D403 树脂馨合残余的领离子，过滤除去馨合树脂，溶液减压浓缩，活性炭脱色，加入无水乙醇在 揽拌、加热、回流状态下结晶。该方法用到了剧毒的领离子，且仍需要树脂来去除重金属离 子，存在制造成本较高，操作复杂、不利于工业化生产等缺陷。
[0006] CN101798275A公开了一种k天口冬氨酸-k鸟氨酸的制备方法，包括下述步骤： 将k鸟氨酸醋酸盐溶于水后，加入k天口冬氨酸，用氨水调节抑值至6-9,加入活性炭脱 色过滤，滤液中加入适量的乙醇或甲醇，揽拌析晶，过滤，干燥，即得。该方法存在产品纯度 不高，单杂超过0. 1%，难W作为原料药进行制剂生产，且起始原料价格较高（700元Ag),不 利于工业化生产等缺陷。
[0007] CN102102118A公开了一种k鸟氨酸A-天口冬氨酸盐的制备方法，通过精氨酸 酶转化生产k鸟氨酸A-天口冬氨酸盐，包括W下步骤：（1)固定化酶的制备：取S乙醇胺 阴离子苯乙締树脂，用碳酸钟溶液浸泡6-1化后过滤，再将滤出的=乙醇胺阴离子苯乙 締树脂与碳酸钟、漠化氨按重量比为1 : (0.1-0. 6) : (0.2-0. 5)配制成溶液，于冰浴中反 应5-60min，调节抑值至7-10,再加入精氨酸酶，使其与S乙醇胺阴离子苯乙締树脂的重量 比为（0. 002-0. 01) : 1，于1-10°C反应12-4化，洗涂后用饱和食盐水浸泡0. 5-化，再利用 去离子水洗净至溶液中检测不出氯离子，即得固定化酶，保存于水中；（2)转化条件的优 化：固定化酶与精氨酸、乙酸儘按重量比1 : (1-3) : (0.004-0. 02)混合，加入去离子水 中，揽拌，采用k天口冬氨酸调节抑值至8. 8-9. 6,在30-50°C下，反应15-1化得固定化 酶混悬液；（3)产物提取和精制工艺步骤：将步骤（2)中的固定化酶混悬液过滤后，向滤液 中加k天口冬氨酸、活性炭，于30-70°C下揽拌反应5-30min后，过滤，将滤液减压浓缩， 浓缩结束，加入醇类，揽拌0. 5-比，析出k鸟氨酸A-天口冬氨酸，保溫3-化，再经降溫至 20-25°C、离屯、、干燥即得产品。该专利酶解碱性强，溫度高，时间长，会导致鸟氨酸聚合产生 杂质。
【发明内容】
[0008]本发明要解决的技术问题是提供一种k天口冬氨酸-k鸟氨酸的制备方法，该方 法反应条件溫和，k天口冬氨酸-k鸟氨酸收率高，且产品成本低、纯度高，易于实现工业 化生产。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种k天口冬氨酸-k鸟氨 酸的制备方法，包括W下步骤： (1) 固定化酶的制备：用超大孔聚苯乙締微球，加去离子水洗涂后过滤作为载体；将 k精氨酸酶固定于该载体上，得到固定化酶； (2) 配料、酶解反应：将心精氨酸加入去离子水中，加入硫酸儘或醋酸儘作为催化剂， 揽拌使溶解，再用盐酸或硫酸调节抑值至8. 3-8. 7,得到k精氨酸溶液，然后加入步骤（1) 中制得的固定化酶；进行酶解反应，将k精氨酸水溶液转化成k鸟氨酸和尿素，反应结束 后过滤得到转化液； (3) 纯化：转化液分别通过强酸性阳离子交换树脂、强碱性阴离子交换树脂吸附、洗脱， 去除杂离子和尿素，得到游离k鸟氨酸溶液； (4) 成盐反应：游离k鸟氨酸溶液中加入k天口冬氨酸，成盐反应得到k天口冬氨 酸-k鸟氨酸溶液； (5) 脱色、结晶，制得产品。
[0010] 优选的，步骤（1)中超大孔聚苯乙締微球平均粒径为100~200微米，孔隙率50~ 70%，比表面积30~40m7g，交联度10~15〇/〇。
[OOU] 优选的，步骤（1)固定化酶的制备方法为：超大孔聚苯乙締微球，加去离子 水洗涂后过滤作为载体；取k精氨酸酶0. 05~0.Ig,加去离子水溶解至40ml，加入 胞2册04-胞&?04缓冲溶液20ml，揽拌升溫至36°C±rC，加入5.Og载体，揽拌18~24小 时，过滤并用去离子水洗涂，即得固定化酶，4°C~8 °C冷藏保存；所述NazHPCM-NaHzPCM缓冲 溶液的浓度为0. 05~0. 2mol/l，抑8. 5~9. 0。
[0012] 超大孔聚苯乙締微球，超大孔指大于生物大分子直径的10至20倍，内部既具有 5-20皿的微孔，又具有50-100皿及100皿W上的超大孔，其中50-100皿及100皿W上 的超大孔占微球内部孔容的10-60%。超大孔聚苯乙締微球刚性大，化学性质稳定，耐受高 压和高流速，耐受有机溶剂性能好，pH值的适用范围广，可耐100°C溫度。
[0013] 优选的，步骤（2)配料：得到的k精氨酸溶液质量浓度为10~20% ;催化剂的用 量为k精氨酸质量的0. 15%-0. 30% ;固定化酶的用量为k精氨酸质量的20-40% ;酶解反 应：控制酶解反应溫度在25-35°C，揽拌2-10小时，将k精氨酸水溶液转化成k鸟氨酸和 尿素，反应结束后过滤得到转化液。
[0014] 进一步优选的，步骤（2)中催化剂为硫酸儘。
[0015] 进一步优选的，步骤（2)中用盐酸调节溶液的抑值至8. 5。
[0016] 进一步优选的，步骤（2)中酶解反应溫度为30°C。
[0017] 优选的，步骤（4)成盐反应：游离心鸟氨酸溶液中加入k天口冬氨酸，成盐反应 得到k天口冬氨酸-k鸟氨酸溶液山-天口冬氨酸与k精氨酸的摩尔比为1 : 1;成盐反 应溫度30-40°C，成盐反应时间2 -地。
[0018] 优选的，步骤（3)中强酸性阳离子交换树脂的型号为001X7型、732型或DOOl型； 强碱性阴离子交换树脂的型号为201X7型、717型或D201型。
[0019] 进一步优选的，步骤（3)中强酸性阳离子交换树脂的型号为732型；强碱性阴离子 交换树脂的型号为717型。
[0020] 步骤（3)纯化：转化液通过强酸性阳离子交换树脂后主要吸附鸟氨酸，用氨水洗 脱。通过强碱性阴离子交换树脂吸附后可吸附阴离子等杂质，用盐酸洗脱。
[0021] 优选的，步骤（5)的方法为：将k天口冬氨酸-心鸟氨酸溶液浓缩，得到浓缩液， 浓缩液中加入活性炭脱色，过滤后滤液中加入有机溶剂进行结晶，过滤，干燥即得产品。
[0022] 进一步优选的，步骤（5)中活性炭的型号为302型、767型或772型，脱色的溫度为 35-45°C，脱色的时间为30-60min;有机溶剂为甲醇、丙酬或体积浓度95%乙醇，有机溶剂的 用量是滤液体积的3-5倍，结晶溫度为35-45°C;干燥为鼓风干燥，干燥溫度为50-70°C。
[0023] 更进一步优选的，步骤（5)中活性炭的型号为767型；有机溶剂为甲醇；干燥溫度 为 60〇C。
[0024] 采用上述技术方案所产生的有益效果在于： (1)本发明方法反应条件溫和，固定化酶的专一性强，k天口冬氨酸-k鸟氨酸收率 高，且产品成本低、纯度高，易于实现工业化生产。