微小rna的实时恒温指数扩增方法
【技术领域】
[0001]本发明属生命科学和生物技术领域，是一种可同时定性和/或定量检测一种或多种微小RNA(microRNA，miRNA)的实时恒温指数扩增方法。
【背景技术】
[0002]与基因组DNA、mRNA和长片段非编码RNA (IncRNA)等核酸分子相比较，微小RNA(microRNA, miRNA)分子具有其特殊性，如:核酸分子片段极小(< 22nt)，GC含量分布广泛(5?95% )，导致恪解温度(melting temperature, Tm)差异大，难于设计匹配的扩增引物和检测探针；所占总RNA的比例极低(< 0.01% )，需要高灵敏度的检测方法；家族分子差异小(可仅有单碱基差异)，对检测特异性的要求高；不同miRNA的表达水平差异极大(可达4个数量级；如:几十个拷贝/细胞至5 X 15拷贝/细胞)，要求检测线性范围宽，同时能够有效识别低丰度miRNA ;革[1序列同时存在于pr1-miRNA和pre-miRNA中；缺乏类似于mRNA的poly(A)尾，使其难以用常规技术手段进行逆转录检测。miRNA的上述特征对其核酸分子检测技术和方法提出了近乎于苛刻的特殊需求。例如，极小的分子片段使常规PCR引物设计策略无法实施，单碱基差异对引物或探针的碱基分辩能力要求极高，GC含量的巨大差异导致引物和探针难于取向于均一的退火温度。
[0003]自1993年首次发现miRNA以来，miRNA的检测方法从Northern Blot探针杂交法逐渐向高通量测序法(如=Solexa法和SoLiD法等)、芯片杂交法、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridizat1n, ISH)、实时焚光逆转录定量 PCR 法(real-timereverse transcript1n quantitative PCR, RT-qPCR)、恒温扩增检测技术发展。由于miRNA靶分子的上述独特属性，现有的每种检测技术和方法特点各异，各有所长，但也都有明显的缺点，从而使每种方法都有其最适合的使用环境。
[0004]以目前最常用的基于芯片杂交法的微阵列技术、高通量测序法和RT-qPCR为例。高通量测序与微阵列的检测通量大，并且，高通量测序还可用于发现新miRNA，但是，这两种方法的定量精确性较差，价格昂贵，一般应用于miRNA的初筛研究。此外，高通量测序技术文库制备复杂，达到兆字节(terabytes, TB)的庞大和复杂文库数据分析需要特殊的计算机资源和相关的生物信息学工具和手段，因此，往往由专业的公司提供。由于miRNA的片段小，且Tm值差异大，微阵列技术不能简单地通过增加和减少探针的长度来均衡不同探针的杂交效率，因此，往往需要借助一些特殊的技术手段，例如使用锁核酸探针(lockednucleic acid, LNA)。以茎环引物 RT-qPCR、poly (T)接头 RT-qPCR 为代表的 RT-qPCR 技术是验证基因组水平miRNA表达谱研究结果最常用和最经典的方法，但是该技术均需逆转录步骤，受多种因素制约的实验数据归一化对检测结果精确度影响大，“热变性-复性-延伸”热循环条件需要高纯度的miRNA，此外，扩增效率受到多种因素的影响和制约，易出现非特异性扩增；扩增反应时间长，一般需要几个小时；受限于热动力学特征，无法精确检测2倍以下的表达差异。
[0005]理想的miRNA检测方法应当具有以下特征:灵敏度高，能够达到检测少量或微量起始材料；特异性好，能够识别仅有单碱基差异的miRNA ;操作简便，无需昂贵的试剂和设备；通用性高，能够应用于miRNA的组织和细胞原位检测、高通量检测、精确定量检测等多个领域。但是，如上所述，受限于miRNA靶分子的特有属性及现有技术的固有局限性，miRNA的现有检测技术往往只能满足上述部分需求。如果能够研发出一种新的能够更好地满足上述需求的技术和方法，一方面，能够得到更广泛的应用，例如，采用一种技术和方法就能实现多个领域的应用，从而有效地拓展非编码RNA (non-coding RNA, ncRNA)的研究深度与广度。
[0006]恒温扩增技术是温度基本不变的核酸扩增技术。相对于以PCR为代表的变温扩增技术，恒温扩增技术具有以下主要优势:反应温度单一，对设备的要求程度低；不存在温度变化，扩增效率及核酸扩增片段长度均优于常规PCR技术；反应时间短，可在I小时，甚至几分钟内实现靶分子的有效扩增，且灵敏度和特异性与PCR技术相当，甚至更好。上述技术优势使恒温扩增技术在生命科学的各个领域得到了广泛应用，并且，特别适合于miRNA的检测。
[0007]目前，已经发展出了多种核酸恒温扩增技术，其中，具有代表性的技术主要包括:链置换扩增(strand displacement amplificat1n, SDA)、环介导核酸等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplificat1n, LAMP)、滚环扩增(rollingcircle amplificat1n, RCA)、依赖于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-basedamplificat1n, NASBA)、依赖于解旋酶的等温扩增技术(helicase-dependentisothermal DNA amplificat1n, HAD)、车专录介导扩增(transcript1n-mediatedamplificat1n, TMA)n 单引物等温扩增(single primer isothermalamplificat1n, SPIA)、信号介导 RNA 扩增技术(signal mediated amplificat1n of RNAtechnology, SMART)、恒温指数扩增(exponential amplificat1n react1n ;EXPAR)。但是，由于miRNA靶分子的特殊性，仅有部分恒温技术适合于miRNA的检测，例如SDA、RCA和EXPAR0但是，受限于现有恒温技术的技术局限性，现有的miRNA恒温检测技术往往只能检测单一 miRNA靶分子，无法实现多个或高通量miRNA的检测。
[0008]无论是变温还是恒温扩增技术，DNA聚合酶均是其反应体系的必需酶。一般而言，DNA聚合酶通常具有以下一种或多种生物学功能:5’ 一 3’扩增活性(amplificat1nactivities)、5’ 一3’ 核酸外切酶活性(exonuclease activities)、3’ 一5’ 核酸外切酶活性、链置换活性(strand displacement activities) ο
[0009]无论是变温还是恒温扩增技术，在引物延伸过程中，当其3’ -延伸末端抵达下游DNA链，即其3’ -延伸末端存在另一条与模板分子互补配对形成的双链DNA (double strandDNA, dsDNA)区域时，如果DNA聚合酶既不具备5’ 一3’外切酶活性，也不具备链置换活性，那么，引物的3’ -末端延伸则受到下游DNA链的阻止而无法继续延伸。但是，当DNA聚合酶具有5’ 一 3’外切酶活性时(如:Taq DNA聚合酶)，该活性可将下游DNA链按照5’ 一 3’方向水解成单核苷酸，从而使引物的延伸得以继续，如实时荧光PCR中的水解探针技术；或者，当DNA聚合酶具有链置换活性时(如:Bst DNA聚合酶)，该活性可以使引物的延伸得以继续，同时，将下游DNA链从dsDNA区域剥离，使下游DNA链变成游离的单链核酸分子。DNA聚合酶的上述链置换活性被广泛应用于多种恒温扩增系统，如SDA、LAMP、RCA等。
[0010]具有链置换活性、缺乏5’ 一 3’外切酶活性的DNA聚合酶被广泛应用于依赖双链核酸分子缺口的链置换反应。所谓双链核酸分子缺口是指双链核酸分子的一条链保持完整性，另一条链的某两个毗邻核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，从而形成一个缺口。该缺口两侧的核酸分子末端分别是3’ -端轻基(3，-hydroxy group, 3’ -OH)和5’ -端磷酸基团(5’ -phosphate group, 5’ -P04)。在上述DNA聚合酶存在的作用下，具有3’ -OH的核酸分子从缺口处3’-OH开始延伸反应，同时，其延伸合成的新生核酸链将下游的旧链剥离，使下游旧链转变成游离的单链核酸分子。
[0011]缺口内切酶(nicking endonuclease)，亦叫缺口酶(nicking enzyme)，是 II 型限制性内切酶(restrict1n endonuclease)中的一类特殊类型酶。目前已经发现280余种缺口酶，商品化的近20余种，并且，其热稳定性到可达到65°C或更高。该类酶只切割双链核酸分子中的一条链，造成一个双链核酸分子缺口，该缺口两侧的核酸分子末端分别是3’ -OH和5’ -P04。完全或部分双链核酸分子中被缺口内切酶识别的核苷酸序列被称为缺口内切酶识别序列(nicking endonuclease recognit1n sequences, NERS) ο
[0012]限制性内切酶中还有一种特殊类型的酶(如=HincII)，该类酶具有常规限制性内切酶的功能，能够识别并在天然双链核酸分子的限制性内切酶识别序列(restrict1nendonuclease recognit1n sequences, RERS)处同时酶切双链核酸分子的两条链。但是，当双链核酸分子中的一条链在RERS序列中至少含有一个衍生核苷酸(如:α巯基-脱氧核苷酸(α-th1 deoxynucleotide)时，该衍生核苷酸可阻止限制性内切酶切割该核酸分子链，因此，只能切割另一条不含有衍生核苷酸的天然核酸分子链。这种仅有一条链的RERS序列含有阻止限制性内切酶切割的双链核酸分子被称为半修饰RESR。可见，能够识别并切割半修饰RERS的限制性内切酶具有与缺口内切酶相似的功能，即可用于制备双链核酸分子缺口。
[0013]缺口内切酶及可识别半切割半修饰RESR的限制性内切酶的上述生物学活性被广泛应用于依赖双链核酸分子缺口的链置换反应，并且，该链置换反应原理被广泛应用于多种恒温扩增技术，如SDA、EXPAR等。例如，在缺口内切酶(或:可识别半切割半修饰RESR的限制性内切酶)和具有链置换活性DNA聚合酶的共同作用下，具有3’ -OH的核酸分子从缺口处3’-OH开始延伸反应，同时，其延伸合成的新生核酸链将下游的旧链剥离。因链延伸而被封闭的缺口可以在缺口内切酶(或:可识别半切割半修饰RESR的限制性内切酶)的作用下重复产生，从而使得“切割-延伸-链置换”的过程能够重复进行，并在此过程中，以线性或指数方式不断剥离或释放出与下游旧链序列相同的单链核酉爱分子(Walker GT, et al.Strand displacement amplificat1n—an isothermal, invitro DNA amplificat1n technique.Nucleic Acids Res.1992 ；20(7):1691-6.Walker GT, et al.Strand displacement amplificat1n—an isothermal, in vitro DNAamplificat1n technique.Nucleic Acids Res.1992 ；20 (7):1691-6.Van Ness J, etal.1sothermal react1ns for the amplificat1n of oligonucleotides.Proc NatlAcad Sci USA.2003 ; 100 (8):4504-9.Shi C, et al.Exponential strand-displacementamplificat1n for detect1n of microRNAs.Anal Chem.2014 ;86 (I):336-9)。
[0014]锁核酸(locked nucleid acid, LNA) —种特殊的双环状寡核苷酸衍生物，其核糖的β -D-呋喃核糖的2’ -O和4’ -C通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3’-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。与其他寡核苷酸类似物相比，DNA/LNA嵌合式寡核苷酸对单碱基变异具有良好的识别能力，以DNA/LNA嵌合引物或探针形式广泛应用于多种分子生物学检测技术中。
[0015]由上可见，如果有效整合缺口酶、具有链置换活性DNA聚合酶和荧光标记DNA/LNA嵌合引物的协同作用优势，就能够在较高单一恒定温度条件下通过“切割-延伸-链置换”自主链式循环实现靶分子的指数扩增，则能为解决miRNA现有技术瓶颈，实现miRNA的床旁快速检测提供坚实的基础。
【发明内容】
[0016]本发明要解决的技术问题是提供一种基于寡核苷酸引物的恒温扩增系统，该系统可在恒定温度条件下，能够在单一恒定温度条件下通过“切割-延伸-链置换”自主链式循环实现靶分子指数扩增的微小RNA实时恒温指数扩增方法。
[0017]为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案:miRNA的实时恒温指数扩增方法，反应混合物包括以下反应成分:
[0018]①具有3’ -端羟基的miRNA靶分子；
[0019]②上游引物和下游引物；
[0020]③DNA聚合酶；
[0021]④识别上游引物和下游引物缺口剂识别序列的缺口剂；
[0022]⑤三磷酸脱氧核苷酸；<