Paep基因及其表达产物作为骨关节炎的诊治靶标的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体地设及人PAEP基因在骨关节炎的诊断、治疗中的 用途。
【背景技术】
[0002] 骨关节炎（Osterart虹itis，OA)是一组由多种原因导致的W关节软骨退行性变 为主要病理特征的临床综合征，是一种常见病，多发生于中年W后，是一种慢性、进展性关 节病变。主要发生在关节软骨。其表现主要是关节软骨受到破坏，软骨表面失去均质性、中 断、斑片凹陷、断裂和溃瘍。近来一些研究表明骨关节炎的发生与遗传因素有关。滑膜对于 维持关节的正常功能，并且在骨关节炎疾病的发生发展过程中起着重要的作用。
[0003]目前临床上对于骨关节炎的诊断主要基于影像学的检查。X线表现主要为关节间 隙狭窄，软骨下骨质硬化及囊性变，关节边缘骨寶形成，关节面萎陷、变形和关节半脱位等。 MRI可示早期软骨、半月板等关节结构的病变，有利于早期诊断。CT用于椎间盘病的诊断， 优于X线。关节间隙变窄，软骨下骨硬化，边缘性骨刺脊椎关节连成骨桥。亦可见骨囊肿W 及崎形。如发现运些变化可作为诊断的依据和估计关节损伤的程度。OA-般在早期没有或 很少有症状，只在继发炎症、疼痛或影响关节的活动时，病人才找医生。此时，关节损伤发生 已久。因为开发用于早期骨关节炎诊断的方法是亟待解决的问题。
【发明内容】
[0004] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于骨关节炎 (Osterart虹itis，OA)早期诊断的分子标志物。相比传统的骨关节炎的诊断方法，使用基 因标志物来诊断骨关节炎的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知 晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。 阳〇化]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明提供了一种人PAEP基因及其表达产物在制备诊断骨关节炎的产品中的应 用。
[0007] 进一步，上面所提到的诊断产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位 杂交或忍片检测PAEP基因及其表达产物的表达水平W诊断骨关节炎的产品。
[0008] 进一步，所述用RT-PCR诊断骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增PA邸基因的 引物；所述用实时定量PCR诊断骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增PAEP基因的引物； 所述用免疫检测诊断骨关节炎的产品包括：与PAEP蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂 交诊断骨关节炎的产品包括：与PAEP基因的核酸序列杂交的探针；所述用忍片诊断骨关节 炎的产品包括：蛋白忍片和基因忍片；其中，蛋白忍片包括与PAEP蛋白特异性结合的抗体， 基因忍片包括与PAEP基因的核酸序列杂交的探针。
[0009] 优选地，所述产品包括忍片、试剂盒。
[0010] 本发明还提供了人PAEP基因在高通量测序平台中的应用。随着高通量测序技术 的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常 人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知人 PAEP基因的异常与骨关节炎相关也属于人PAEP基因的用途，同样在本发明的保护范围之 内。
[0011] 本发明还提供了人PAEP基因及其表达产物在制备治疗骨关节炎的药物中的应 用。
[0012] 进一步，所述药物包括：含有人PAEP基因的药物、携带人PAEP基因的载体或宿主 细胞所形成的药物、人PAEP蛋白质药物、或其他能够促进PAEP基因表达的药物。本发明的 药物可W用于补充内源性的人PAEP蛋白的缺失或不足，通过提高人PAEP蛋白的表达，从而 治疗因人PAEP蛋白缺乏导致的骨关节炎。
[0013] 本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、 粘粒、隧菌体、病毒等。
[0014] 在本发明中，术语"宿主细胞"包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的 例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物 细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
[0015] 进一步，本发明的药物还包括药学上可接受的载体，载体，运类载体包括（但并不 限于）：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、薦糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明 胶和聚乙締化咯烧酬；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸巧和碳酸氨钢；吸收促进剂季锭 化合物；表面活性剂如十六烧醇；吸附载体如高岭±和皂粘± ;润滑剂如滑石粉、硬脂酸巧 和儀、聚乙二醇等。
[0016] 本发明的药物导入组织或者细胞的方式可W分为体外或者体内的方式。体外方式 包括将含有人PAEP基因的药物或者含有人PAEP蛋白质的药物导入细胞中，再将细胞移植 或回输到体内。体内方式包括直接将含有人PAEP基因的药物或者含有人PAEP蛋白质的药 物注入体内组织中。
[0017]本发明的药物还可与其他治疗骨关节炎的药物联用，多种药物联合使用可W大大 提到治疗的成功率。
[0018] 本发明还提供了一种诊断骨关节炎的忍片，所述忍片包括基因忍片、蛋白质忍片； 所述基因忍片包括固相载体W及固定在固相载体的寡核巧酸探针，所述寡核巧酸探针包括 用于检测PAEP基因转录水平的针对PAEP基因的寡核巧酸探针；所述蛋白质忍片包括固相 载体W及固定在固相载体的PAEP蛋白的特异性抗体。
[0019] 进一步，所述基因忍片可用于检测包括人PAEP基因在内的多个基因（例如，与骨 关节炎相关的多个基因）的表达水平。所述蛋白质忍片可用于检测包括人PAEP蛋白在内 的多个蛋白质（例如与骨关节炎相关的多个蛋白质）的表达水平。通过将多个与骨关节炎 的标志物同时检测，可大大提高骨关节炎诊断的准确率。
[0020] 本发明提供了一种诊断骨关节炎的试剂盒，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋 白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测PAEP基因转录水平的试剂；所述蛋 白免疫检测试剂盒包括PAEP蛋白的特异性抗体。
[0021] 进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或忍片方 法检测PAEP基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对PAEP基因的引 物和/或探针。根据PAEP基因的核巧酸序列容易设计出可W用于检测PAEP基因表达水平 的引物和探针。
[0022] 与PAEP基因的核酸序列杂交的探针可W是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它 衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核巧酸序列特异性结合， 任何长度都可W。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针 的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度 对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一 般不超过30个碱基对，与目的核巧酸序列互补的长度W15-25个碱基对最佳。所述探针自 身互补序列最好少于4个碱基对，W免影响杂交效率。
[0023] 进一步，所述PAEP蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述PAEP 蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰（例如，，嵌合抗体、scFv、 Fab、F(ab')2、Fv等。只要所述片段能够保留与PAEP蛋白的结合能力即可。用于蛋白质 水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可W使用任何方法来制备所述抗 体。
[0024] 在本发明的上下文中/'PAEP基因"包括人PAEP基因W及人PAEP基因的任何功能 等同物的多核巧酸。PAEP基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中PAEP基因 (NC_000009. 12)DNA序列具有70%W上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列； 阳0巧]优选地，PAEP基因的编码序列包括W下任一一种DNA分子：
[0026] (1)序列表中沈Q ID NO. 1所示的DNA序列；
[0027] 似在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列； 阳02引 做与（1)或似限定的DNA序列具有70%、优选地，90%W上同源性，且编码相 同功能蛋白质的DNA分子。
[0029] 在本发明的具体实施方案中，所述PAEP基因的编码序列是SEQIDNO. 1所示的 DNA序列。
[0030] 在本发明的上下文中，PAEP基因表达产物包括人PA