实时荧光恒温指数扩增方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生命科学和生物技术领域，是一种可同时定性和/或定量检测多种核酸 祀分子的实时巧光恒溫指数扩增方法，可广泛应用于miRNA、mRNA、CDNA和基因组DNA等各 种祀分子的现场快速检测。
【背景技术】
[0002] 核酸扩增技术（nucleicacidamplificationtechnologies,NAT)被广泛应用于 生命科学的各个领域，如遗传性疾病、感染性疾病、肿瘤疾病、食品安全、法医学。核酸扩增 技术的简便性、高效性、特异性、夷敏度、准确度、精确度，W及经济可承受性至关重要。
[0003] 目前，主要有两大类核酸扩增技术，分别是基于温度热循环的变温扩增技术， 例如聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR)和连接酶链式反应Qigase chainreaction，LCR)，W及温度基本不变的恒温扩增技术（iso化ermalamplification technology)〇
[0004] WPCR为代表的变温扩增技术具有检测夷敏度高、特异性好等优势，是目前最精 准的基因诊断方法之一D但是，却存在1^下缺陷（化angCC，etal.Diagnosticdevices forisothermalnucleicacidamplification.Sensor. 2012 ; 12:8319-37):需要反 复的热变性WDNA双链，无法摆脱依赖高质量热循环仪的局限；扩增效率受到多种因素 的影响和制约，易出现非特异性扩增；扩增反应时间长，一般需要几个小时。上述技术 缺陷使PCR技术难于胜任生命科学领域的一些特殊用途，如现场快速检测或床旁检测 (point-〇f-c过retesting，POCT)D
[0005] 恒温扩增技术是温度基本不变的核酸扩增技术。相对于PCR，恒温扩增技术具 有下主要优势（ChangCC，etal.Diagnosticdevicesforisothermalnucleicacid amplification.Sensor. 2012 :12:8319-37):反应温度单一，对设备的要求程度化；不存在 温度变化，扩增效率及核酸扩增片段长度均优于常规PCR技术；反应时间短，可在1小时，甚 至几分钟内实现靴分子的有效扩增，且夷敏度和特异性与PCR技术相当，甚至更好。上述技 术优势使恒温扩增技术在生命科学的各个领域得到了广泛应用，并且，特别适合于现场快 速检测或床旁检测。
[0006] 目前，已经发展出了多种核酸恒温扩增技术，其中，具有代表性的技术主要 包括：链置换扩增（stranddisplacementamplification,SDA)、环介导核酸等温 扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)、滚环扩增（rolling circleamplification,RCA)、依赖于核酸序列的扩增（nucleicacidsequence-based amplification，NASBA)、依赖于解旋酶的等温扩增技术化elicase-d邱endentisothermal DNAamplificatio打，HAD)、转录介导扩：t曾(transcription-mediatedamplification, TMA)、单引物等温扩增（singleprimerisothermalamplification，SPIATm)、信号介导 RNA扩增技术（signalmediatedamplificationofRNAtechnology,SMART)、恒温指数 扩增（exponentialamplificationreaction;EXPAR)D各种恒温扩增技术充分利用了 DM聚合酶、DM连接酶、限制性内切酶等不同酶的生物学功能，不同恒溫扩增技术的具体 工作原理可参见YanL等的相关述评（Yanl^，etal.Isothermalamplifieddetection ofDNAandRNA.Mol6103731:.2014:10(5):970-1003.1^10^11(1(1:111M，etal.Nucleic acidamplification!Alternativemethodsofpolymerasechainreaction.JPharm BioalliedSci.2013Oct;5(4):245-52.ChangCC,eal.Diagnosticdevicesfor isothermalnucleicacidamplification.Sensor.2012 ; 12:8319-37.KimJ，et al.IsothermalDNAamplificationinbioanalysis:strategiesandapplications. Bioanalysis. 2011 ;3 (2):227-39.KimJ，etal.IsothermalDNAamplificationin bioanalysis:strategiesandapplications.Bioanalysis. 2011 ;3 (2):227-39.GillP， etal.Nucleicacidisothermalamplificationtechnologies:areview.Nucleosides NucleotidesNucleicAcids. 2008 ;27 (3):224-43)。
[0007] 无论是变溫还是恒溫扩增技术，DM聚合酶均是其反应体系的必需酶。一般而 言，DNA聚合酶通常具有W下一种或多种生物学功能：5' 一 3'扩增活性（amplification activities)、5' 一 3' 核酸外切酶活性（exonucleaseactivities)、3' 一 5' 核酸外切酶活 性、链置换活性（stranddisplacementactivities) 〇
[0008] 无论是变溫还是恒溫扩增技术，在引物延伸过程中，当其3' -延伸末端抵达下游 DNA链，即其3' -延伸末端存在另一条与模板分子互补配对形成的双链DNA(doublestrand DM,dsDNA)区域时，如果DNA聚合酶既不具备5' 一 3'外切酶活性，也不具备链置换活性， 那么，引物的3' -末端延伸则受到下游DNA链的阻止而无法继续延伸。但是，当DNA聚合酶 具有5' 一 3'外切酶活性时（如：TaqDNA聚合酶），该活性可将下游DNA链按照5' 一 3' 方向水解成单核巧酸，从而使引物的延伸得W继续，如实时巧光PCR中的水解探针技术；或 者，当DNA聚合酶具有链置换活性时（如：BstDNA聚合酶），该活性可W使引物的延伸得W 继续，同时，将下游DNA链从dsDNA区域剥离，使下游DNA链变成游离的单链核酸分子。DNA 聚合酶的上述链置换活性被广泛应用于多种恒溫扩增系统，如SDA、LAMP、RCA等。
[0009] 具有链置换活性、缺乏5' 一 3'外切酶活性的DNA聚合酶被广泛应用于依赖双链 核酸分子缺口的链置换反应。所谓双链核酸分子缺口是指双链核酸分子的一条链保持完 整性，另一条链的某两个邮邻核巧酸之间的憐酸二醋键断裂，从而形成一个缺口。该缺口 两侧的核酸分子末端分别是3' -端径基（3' -hy化oxygroup, 3' -0H)和5' -端憐酸基团 保-phosphategroup, 5' -P04)。在上述DNA聚合酶存在的作用下，具有3' -OH的核酸分子 从缺口处3'-OH开始延伸反应，同时，其延伸合成的新生核酸链将下游的旧链剥离，使下游 旧链转变成游离的单链核酸分子。
[0010] 缺口 内切酶（nickingendonuclease)，亦叫缺口酶（nickingenzyme)，是II型限 制性内切酶（restrictionendonuclease)中的一类特殊类型酶。目前已经发现280余种 缺口酶，商品化的近20余种，并且，其热稳定性到可达到65°C或更高。该类酶只切割双链核 酸分子中的一条链，造成一个双链核酸分子缺口，该缺口两侧的核酸分子末端分别是3'-OH 和5' -P04。完全或部分双链核酸分子中被缺口内切酶识别的核巧酸序列被称为缺口内切酶 识另Il序歹Ll(nickingendonucleaserecognitionsequences,NERS) 〇 W11] 限制性内切酶中还有一种特殊类型的酶（如：Hincn)，该类酶具有常规限制性 内切酶的功能，能够识别并在天然双链核酸分子的限制性内切酶识别序列（restriction endonucleasereco即itionsequences,RER巧处同时酶切双链核酸分子的两条链。但是， 当双链核酸分子中的一条链在RERS序列中至少含有一个衍生核巧酸（如：a琉基-脱氧 核巧酸（a-thiodeoxynucleotide)时，该衍生核巧酸可阻止限制性内切酶切割该核酸分 子链，因此，只能切割另一条不含有衍生核巧酸的天然核酸分子链。运种仅有一条链的RERS 序列含有阻止限制性内切酶切割的双链核酸分子被称为半修饰RESR。可见，能够识别并切 割半修饰RERS的限制性内切酶具有与缺口内切酶相似的功能，即可用于制备双链核酸分 子缺口。
[0012] 缺口内切酶及可识别半切割半修饰RESR的限制性内切酶的上述生物学活性被 广泛应用于依赖双链核酸分子缺口的链置换反应，并且，该链置换反应原理被广泛应用 于多种恒溫扩增技术，如SDA、EXPAR等。例如，在缺口内切酶（或：可识别半切割半修 饰RESR的限制性内切酶）和具有链置换活性DNA聚合酶的共同作用下，具有3'-OH的 核酸分子从缺口处3'-OH开始延伸反应，同时，其延伸合成的新生核酸链将下游的旧链 剥离。因链延伸而被封闭的缺口可W在缺口内切酶（或：可识别半切割半修饰RESR的 限制性内切酶）的作用下重复产生，从而使得"切割-延伸-链置换"的过程能够重复进 行，并在此过程中，W线性或指数方式不断剥离或释放出与下游旧链序列相同的单链核 酉《分子（WalkerGT,et曰 1.Stranddisplacementamplification-anisotherm曰I,in vitroDNAamplificationtechnique.NucleicAcidsRes. 1992 ;20 (7):1691-6. WalkerGT,etal.Stranddisplacementamplification-anisothermal,invitroDNA amplificationtechnique.NucleicAcidsRes. 1992 ;20 (7):1691-6.VanNessJ,et al.Isothermalreactionsfortheamplificationofoligonucleotides.ProcNatl AcadSciUSA. 2003; 100 (8) :4504-9.ShiC,etal.Exponentials1:rand-displacement amplificationfordetectionofmicroRNAs.AnalChem. 2014 ;86 (I):336-9)。 阳01引 Van化SSJ等在2003年通过联用缺口内切酶和DNA聚合酶，建立了一种能够 W指数形式扩增寡核巧酸片段的恒溫扩增技术，该技术被称为EXPAR(Van化SSJ，et al.Isothermalreactionsfortheamplificationofoligonucleotides.ProcNatl AcadSciUSA. 2003 :100(8) :4504-9)。相对于已有的恒溫扩增技术，该技术具有十分高 的扩增效率和检测灵敏度，能够在几分钟内实现祀分子的1〇6扩增，相关专利见WIPO(NO. W02004067726)及美国专利（No.US60/443,652 29.01.2003)。相关研究者在此基础 上，通过技术改良，将该技术进一步用于纳米金、薄层层析快速检测等领域（RoskosK，et al.SimplesystemforisothermalDNAamplificationcoupledtolateralflow detection.PLoSOne. 2013Jul26 ;8巧）：e69355;TanE,IsothermalDNAamplification coupledwithDNAnanosphere-basedcolorimetricdetection.AnalChem. 2005Dec 15 ;77 (24):7984-92)。
[0014]EXPAR原型设计及在此基础上发展起来的相关技术中，为了实现指数扩增，缺 口内切酶的肥RS反义链序列两侧的核巧酸序列基本完全相同，并且，用于扩增寡核巧酸 片段的模板是单纯线性核酸分子（VanNessJ,etal.Isothermalreactionsforthe amplificationofoligonucleotides.Proc化tlAcadSciUSA. 2003 ;100(8):4504_9)。 此原理存在的主要缺陷在于，只有当引物与肥RS反义链序列的3'-端核巧酸序列互补结合 时，才能触发线性或指数扩增。但是，肥RS反义链序列两侧的核巧酸序列基本完全相同，因 此，引物与肥RS反义链序列5' -和3' -端两侧核巧酸序列的互补结合是一种随机事件，运 种随机性势必会影响该体系的扩增效率，从而影响整个检测系统的检测灵敏度，最终降低 该技术在生物科学领域的实际应用价值。此外，包括EXPAR在内的多种恒溫扩增技术（如： LAMP、RCA)往往只能检测单种祀分子，并且，检测手段主要依靠凝胶电泳或DNA非特异性染 料（如：SYBRGreen),或者，依赖于其它技术手段，如DNA质谱技术。上述技术瓶颈在一定 程度上限制了现有恒溫扩增技术的应用价值，特别是在需要尽可能实现祀分子多重检测的 生命科学领域，例如感染性病原体和miRNA的检测。可见，如何提高祀分子与肥RS反义链 序列3'-端序列的特异性结合，W及实现祀分子的多重检测，对于极大地拓展现有恒溫扩 增技术的应用领域具有重要实用价值。
[0015] 发夹型寡核巧酸是一类具有亚稳定状态的茎环状短片段DNA序列，被广泛 应用于生物医学检测的各个领域，如实时巧光PCR(MackayJ,etal.Real-timePCR fluorescentchemistries.MethodsMolBiol. 2007;353:237-61)、杂交链反应值irks RM,etal.Triggeredamplificationbyhybridizationchainreaction.ProcNatl AcadSciUSA. 2004 0ct26 :101(43): 15275-8)。发夹型寡核巧酸的最大特征在于其分子 内杂交双链的热稳定性，同时，可在其茎状结构末端的互补碱基对分别标记巧光报告基团 和巧光泽灭基团，从而实现祀分子特异性的多重巧光检测，其典型应用代表包括分子信标 (TyagiS,etal.Molecularbeacons:probesthatfluoresceuponhybridization.Nat Biotechnol. 1996; 14:303-8)、发夹式引物（化zarenkoIA,etal.Aclosed1:ubeformat foramplificationanddetectionofDNAbasedonenergytransfer.NucleicAcids Res. 1997;25:2516-21)、蜗形引物（WhitcombeD,etal.DetectionofPCRproducts usingself-probingampliconsandfluorescence.NatBiotechnol. 1999Aug; 17(8) :804-7)。例如，发夹式引物和分子信标基础上演变而来的蜗形引物由两部分构成，分 别是3' -端的引物序列区和5' -端具有分子信标结构与特性的探针序列区，引物序列区与 探针序列区之间用延伸阻断剂（extensionblocker)连接，W阻止PCR产物沿探针序列延 伸。探针序列区呈亚稳定状态的茎环结构。在游离状态时，探针序列区茎部结构的5'-末 端和3'-末端分别标记的巧光报告基因和泽灭基团在巧光共振能量转移（fluorescence resonanceenergytransfer，FRET)作用下不产生巧光信号。在引物延伸阶段，探针序列 区的环状序列与引物的3'-末端延伸产物形成分子内杂交双链，从而使原有的茎部结构被 破坏而释放巧光信号（DetectionofPCRproductsusingself-probin邑ampliconsand fluorescence.化tBiotechnol. 1999Aug; 17 (8) :804-7.MackayJ,etal.Real-timePCR fluorescentchemistries.MethodsMolBiol. 2007;353:237-61)。
[0016]由上可见，如果能将发夹型寡核酸的热稳定性、基于巧光标记的多重检测特性揉 合至恒溫扩增技术，就可创建出一种新型的恒溫扩增技术，提高扩增特异性，实现祀分子的 多重并行检测，极大地拓展现有恒溫扩增技术的应用领域。
【发明内容】
[0017] 本发明所要解决的技术问题是提供一种基于巧光标记寡核巧酸模板的恒溫扩增 系统