基于环境dna技术对鱼类dna丰度估算的联合分析法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生态学的鱼类数量评估技术领域，尤其设及水体环境DNA的样品 对近缘种鱼类的鉴定区分W及定量的分析，具体是指一种基于环境DNA技术对鱼类DNA丰 度估算的联合分析法。
【背景技术】
[0002] 国内目前用于鱼类数量的方法主要有标记重捕法和声学探测法。标记重捕法是通 过对水体中的鱼类进行标记后捕拱，进行鱼类物种数量的统计。该方法的实现主要是通过 各种标记和捕拱工具（如各种网具、钓具、电捕等）对于鱼类进行捕获而完成。该方法存在 W下几方面的问题：1、标记的选取及放置工作需要大量的工作，损耗人力、物力。2、重捕强 度要求高。需要通过大量的捕拱工作，并且需要足够大的重捕数量，成本投入较大且难W保 证准确性。3、该方法需要捕获活体，难W保证被捕获鱼类的存活，对于鱼类资源有一定的破 坏。4、对于稀有物种、外来物种的监测调查由于其数量稀少，无法有效进行标记和重捕，难 W取得良好的效果，调查结果更加容易产生偏差。
[0003] 声学探测法利用回声探测仪对各个水体的鱼类资源状况进行了评估。研究通过回 声成像，并充分结合分层拖网的鱼类取样，进行积分分配，从而得到目标强度与鱼体长度的 换算关系式，最后估算水域鱼类资源量及分布，其结果相对捕拱法更为准确。然而该技术还 是要建立在捕拱的基础上，不仅存在上述的问题，该技术还受到水域理化指标和天气状况 的限制，而且对于大面积水域的调查仍有很大的局限性。在物种鉴定方面，该方法也无法实 现准确有效的物种鉴定和群落结构的分析。对鱼群数量的估计也并不具有可靠性。
[0004] 环境DNA是指从有机体脱落释放进入到自然环境中（如空气、水、±壤等）的DNA， 包括细胞中的DNA和细胞破碎后游离出细胞外的DNA分子。环境DNA技术就是直接从水、 ±壤、沉积物等环境样本中提取DNA片段，后通过DNA二代测序和实时定量PCR等分子生物 学检测技术来定性或定量目标生物，从而确定目标生物在该环境中的分布及功能特征的研 究方法。环境DNA的应用最早是从±壤、沉积物中直接提取出来DNA基因组，用来研究微生 物多样性W及物种鉴定，后来在生态学的研究中关于环境DNA的应用得到进一步的发展， 逐渐从微生物学拓展到了动植物学研究领域中。由于水环境的特殊性，加上水生动物在水 中的流动性、易躲藏、不易捕拱等特点，在大面积的水域中有关水生动物方面的调查研究往 往费时费力不易进行。但是环境DNA的应用为我们在水生动物资源调查方面提供了一条良 好的思路。
[0005] 而在环境DNA的研究分析当中，国外多用于对于外来物种和稀有物种的监测，比 如，在北美淡水生态系统中对于入侵亚洲經鱼的监测，W及日本对于蓝觸太阳鱼入侵的监 。研究采用qPCR方法，设计一套针对目标物种线粒体基因序列的特异的引物和探针，即 可完成对于目标物种的DNA丰度的测算，并且通过DNA的丰度进而来评估目标物种的生物 量丰度。但是，运些物种由于在研究地属于归化物种，生态系统中其他物种与其亲缘关系很 远，因此在对运些物种进行研究时，获得扩增运些物种的特异的引物序列是容易的。而当我 们在研究一些重要的本±物种时，如經科鱼类的某些物种，由于大量近缘物种的存在，在对 包含有多种物种的DNA的混合的环境DNA样品进行线粒体基因的扩增时，往往很难获取有 效的物种特异引物，运一问题使得我们通过直接定量PCR的方法，难W获取目标物种的DNA 丰度信息，运一问题尚未得到有效解决。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服了上述现有技术的缺点，提供了一种不依赖物种特异引物， 而采用鱼类线粒体通用引物进行二代测序技术（如454测序）和实时定量PCR(qPCR)联合 分析获取目标物种DNA丰度评价鱼类分布的方法。
[0007] 为了实现上述目的，本发明具有如下构成：
[0008] 该基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法，其主要特点是，所述的联 合分析法包括：
[0009] 定时定量PCR获取鱼类的总DNA丰度，在设计好的通用引物下构建DNA标准品，扩 增后提取DNAW制作标准曲线；
[0010] 将待测试的各环境DNA样本在标准品条件下进行反应，反应后带入标准曲线W获 得各环境样点的DNA相对丰度拷贝数；
[0011] 454GS-FLXTitanium测序分析鱼类物种组成比例；
[0012] 测序数据和实时定量PCR数据联合分析目标物种，计算公式为：目标物种线粒体 基因拷贝数=实时定量PCR定量的鱼类总线粒体基因拷贝数X二代454测序获得的目标 物种线粒体序列的百分比；
[0013] 使用SUfer8.0软件完成对环境中鱼类线粒体DNA相对分布图绘制。
[0014] 优选地，所述的各环境DNA样本为提前根据水域大小，设置样点并采集柱状水层 混合后的水样冷藏，在实验室中抽滤，后提取DNA冷藏备用。
[0015] 更优选地，所述的水样在24h内进行抽滤处理，滤膜孔径为1.2ym，抽滤后使用 DNA提取试剂盒提取滤膜中的所有环境DNA，提取好的DNA在-20°C条件下保存备用。
[0016] 进一步优选地，所述的通用引物选择在16srRNA基因区域进行通用引物和探针设 计，所设置的16srRNA基因正向引物序列为SEQIDNO: 1所示的核巧酸序列；16srRNA基 因反向引物序列为SEQIDN0:2所示的核巧酸序列；16srRNA基因探针序列为SEQIDN0:3 所示的核巧酸序列。
[0017] 更进一步优选地，所述的标准曲线制备过程具体如下：
[001引扩增包含检测目的的鱼类线粒体16s rDNA基因部分序列，进行PCR反应，反应产 物经电泳检测后，采用TIANgel Midi Purification Kit,对PCR产物进行回收纯化；
[0019] 将所述的PCR产物连接到PMD19-T载体上，转化入感受态细胞中，挑选菌斑进行培 养，提取质粒后进行限制性内切酶处理，琼脂糖凝胶电泳；
[0020]DNA胶回收后进行浓度测定，在A260/A280大于1. 8的情形下，按下述公式计算质 粒拷贝数：拷贝数= 6.02X1023X质粒浓度（ng/iiL)/化48X质粒总长度）（g/mol);
[0021] 质粒总长度=2692bp+PCR产物长度；
[0022] 其中，6. 02X1023是阿佛加德罗常数；648是每个碱基的平均分子量；
[002引 使用EASYDilution将构建的DNA标准品分别按照1X10\ 1X106、1X105、1X104、 I XlO3、I XlO2、I X IQicopies/yL梯度稀释作为模板进行Real Time PCR反应，制作DNA标 准曲线，每种浓度标准质粒设3个重复，并做无模板对照；
[0024] 对构建的DNA标准品进行扩增反应，反应采用两步法：95°C80s预变性；95°C变性 5s，55°C退火10s，72°C延伸21s，45个循环，反应结束后得到各自的Ct值，WCt值为纵坐 标，起始模板浓度的对数作为横坐标，制作标准曲线。
[0025] 再进一步优选地，所述的各环境样点的DNA相对丰度拷贝数的测定过程具体如 下：
[0026] 反应条件和体系与制作标准品曲线时相同，各环境DNA样本不做稀释直接添加， 每个样本设置2个平行，计算变异系数；反应后得到样品Ct值，把待测样品的Ct值代入标 准曲线表达式可W算出它的初始拷贝数；由拷贝数可知所测物种在各样点的DNA相对丰度 情况。
[0027] 最优选地，所述的454GS-FLXTitanium测序分析鱼类物种组成比例具体为：
[002引选取16srRNA基因为引物，其中所设置的16srRNA基因F引物序列为SEQID N0:4所示的核巧酸序列；16srRNA基因R引物序列为SEQIDN0:5所示的核巧酸序列；
[0029] 对环境样品DNA进行扩增，切胶回收后干冰保存；
[0030] 测定样品浓度，将不同样品等摩尔混合，将3'端和5'端有特异性的接头连接到 DNA片段上，变性后处理回收单链的DNA，接头使成百上千条DNA片段分别结合到一个磁珠 上，经过乳化扩增，磁珠被单个油水混合小滴包被后，在运个小滴里进行独立的平行扩增， 产生数百万个形同的拷贝，最后将经过富集携带DNA片段的磁珠与其他反应物混合，放入 到PicoTiterPlate板中开始测序；
[0031] 使用Qiimel. 5.0对初始序列质量进行控制和筛选。之后再使用PyNAST对序列进 行去杂和修剪；序列优化后使用化arse提取非重复序列，便于降低分析中间过程冗余计算 量，再按照97%相似性对非重复序列进行OTU聚类，在聚类过程中化hime被用来检测序列 中的嵌合体序列并去除，得到OTU的代表序列；用全部序列与OTU的代表序列进行Blast比 对，得到每条序列与最相近的OTU的代表序列对应表，利用得到的OTU在NCBI数据库中对 于测得序列所属的物种种类进行鉴定，并统计OTU的出现率从而得到鱼类的线粒体基因的 组成比例信息。
[0032] 采用了该发明中的联合分析法，具有如下的技术效果：
[0033] 1、本发明基于环境DNA鉴定技术，不依赖于鱼类物种的捕获，只需要采集水体样 品即可对物种的有无和多少进行分析，采样方法简单，且可W最大限度的保护鱼类资源；同 时，对于一些分布较少难W捕获的物种，该方法也较传统捕拱调查更为有效。
[0034] 2、本方法利主要利用了两种分子生物学鉴定技术，运两种方法的灵敏性都很强： 454测序法可W对样品进行深度测序，每个样品的测序数在10000条-20000条W上，也就是 说，比例在万分之一的物种理论上都可W被检出；实时定量PCR的方法在理论上也可W检 测出每毫升样品中最低10个拷贝的DNA序列；两者共同保证了该方法的灵敏性和准确性。
[0035] 3、利用通用引物的454测序和实时定量PCR结果联合分析物种相对丰度，可W避 免近缘种DNA存在与环境样品中时物种特异引物难W设计，检测误差大等问题，有效地对 目标物种进行准确定量。
[0036] 4、利用通用引物的454测序和实时定量PCR结果，可W轻易的