一种检测发热伴血小板减少综合征病毒的恒温扩增试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种试剂盒及其应用，尤其是一种检测发热伴血小板减少综合征病毒 的恒溫扩增试剂盒及应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 发热伴血小板减少综合征（severefeverwitht虹omboc}ftopenia syn化ome，SFT巧是威胁我国人民健康和公共卫生安全的重要新发传染病，其临床表现W发 热伴血小板、白细胞减少和消化道症状为主要特征，重症死亡率高达15~30%。SFTS很容 易与血液、消化、呼吸等多系统疾病相混淆，加上临床医生对其缺乏认知，给该病的诊断和 鉴别诊断带来困难。发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSvirus,SFTSV)需要通过实验室 手段进行确诊，常用的方法有病毒分离培养、病毒核酸检测和免疫学检测等。病毒分离和免 疫学检测或是操作复杂、费时，不能快速得到检测结果，或是检测敏感度不够。当前，基于 PCR技术（常规PCR或巧光定量PCR)对病毒核酸进行检测是对SFTS进行早期快速诊断的 重要手段。PCR技术具有检测敏感性高，操作简单、快速等优点，然而其前期投入费用较大 (对实验室功能分区W及PCR仪的依赖），而且易受实验室污染而导致假阳性，加上SFTS为 人兽共患自然疫源性疾病，多发生于山区和丘陵等医疗卫生条件相对较差的地区，所W，亟 待建立一种快速、可靠的，适合基层单位和现场应用的SFTSV核酸检测技术。申请人检索发 现W下相关专利申请：①新型布尼亚病毒环介导逆转录等溫扩增检测方法及试剂盒，申请 号：201510018039.0,公开了检测新型布尼亚病毒的方法和试剂盒，反应体系中添加了外源 性染料，通过染料的颜色变化观察样品。②一种新布尼亚病毒的恒溫扩增检测试剂盒及检 测方法，【申请号】201410795993. 6,公开了快速检测新布尼亚病毒的试剂盒，并不能对核酸 的逆转录步骤进行监测。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提出一种检测发热伴血小板减少综合 征病毒的恒溫扩增试剂盒及应用，适合基层单位和现场应用的，能够快速、灵敏、准确地检 测出发热伴血小板减少综合征病毒核酸。
[0004] 本发明通过W下技术方案解决技术问题，首先提供一组检测发热伴血小板减少综 合征病毒的寡核巧酸，包括上下游链置换引物、上下游探针和交叉扩增引物； 阳〇化]所述上下游链置换引物分别为
[0006] SFTS-M-F3：5^ -TGGATGTTGGCCACTCTC-3^ ；
[0007]SFTS-M-B3:5< -TTCTTCTGATTCAGAACA-3';
[0008] 所述上下游探针分别为
[0009] 上游5'端FITC标记探针
[0010] SFTS-M-DWF:5f-FnC-GAGAGCTCATCCAAGGAT-3<;
[0011] 下游5'端Biotin标记探针
[0012] SFTS-M-D巧B:5< -Biotin-AGCACAAGACCAAATGGGT-3< ;
[0013] 所述交叉扩增引物为
[0014]SFTS-M-CPR：
[0015] 5 ^-AGCACAAGACCAAATGGGTTCCCTTCCTTATAGC
[0016]ACAC-3'。
[0017] 本发明进一步提供含有寡核巧酸的检测发热伴血小板减少综合征病毒的恒溫扩 增试剂盒，包括W下组分： 阳01引 （I)RNA提取试剂；
[0019] (2)恒溫扩增反应液，包括1XBstBuffer、甜菜碱、M拆〇4、dNTPs、RNase抑制剂、 BstDNA聚合酶、AMV逆转录酶、灭菌去离子水、所述上下游链置换引物、上下游探针和一条 交叉扩增引物；
[0020] (3)阳性对照模板，为发热伴血小板减少综合征病毒M基因片段的体外转录产物； [OOW(4)阴性对照，灭菌去离子水。 阳02引 进一步地，所述恒溫扩增反应液含有抑=8. 820mMTris-肥1、IOmMKCl、 10mM(NH4)2S04、6mMMgS04、0.l%TritonX-100%、8UBstDNA聚合酶、IOUAMV逆转录酶、IM甜菜碱、IOURNaseInhibitor、dNTPs各0.8mM、上下游链置换引物各O.lyM、上下游探针 各0.3~0.5yM、交叉扩增引物0.5yM。
[0023] 所述阳性对照模板按如下步骤制备，W下游链置换引物和带有T7启动子的上游 链置换引物对发热伴血小板减少综合征病毒的基因组RNA进行RT-PCR扩增；利用PCR产物 纯化试剂盒对扩增产物进行纯化；WT7RNA聚合酶体外转录目的RNA片段；W紫外分光光 度计测Aze。对RNA片段进行定量，将阳性对照模板稀释至10 5拷贝/y1，分装后-20°C保存。
[0024] 本发明还提供检测发热伴血小板减少综合征病毒的恒溫扩增试剂盒的应用，包括 W下步骤： 阳0巧]第一步、用RNA提取试剂从待检标本中提取病毒RNA;
[00%] 第二步、将步骤一提取得到的病毒RNA作为模板加入到装有恒溫扩增反应液的PCR管中；对照PCR管中分别加入阳性对照模板和阴性对照；60°C扩增反应60min;
[0027] 第S步、将反应后的PCR管置入垂直流动核酸试纸条防污染检测装置（杭州优思 达生物技术公司）中进行检测，5min后判读实验结果：当试纸条的质控线和检测线均呈红 色时，为阳性，说明样品中含有发热伴血小板减少综合征病毒核酸；当试纸条的质控线呈红 色，而检测线为无色时，为阴性，说明样品中不含有发热伴血小板减少综合征病毒核酸；当 试纸条的质控线呈无色时，无论检测线是否为红色，均表明实验失败，再对样品进行重复检 测。
[0028] 上述方法的所述垂直流动核酸试纸条防污染检测装置中，试纸条位于带有不干胶 的衬垫上，按顺序依次为样品垫、有色颗粒结合物垫、纤维膜和吸水滤纸垫，上述各部分在 相邻处部分重叠，其中有色颗粒结合物垫上的有色颗粒包被有亲和素；纤维膜上设有检测 线和质控线，其中检测线上包被有抗FITC抗体，质控线上包被有生物素。
[0029] 本发明试剂盒中的5条寡核巧酸引物在BstDNA聚合酶高活性的链置换特性下， 对AMV逆转录酶逆转录产生的CDNA进行不断的DNA链置换扩增循环，并将垂直流动核酸 试纸条检测系统应用到恒溫扩增产物的检测中，建立了发热伴血小板减少综合征病毒核酸 的恒溫扩增检定性检测方法。本发明所提供的发热伴血小板减少综合征病毒恒溫扩增检测 试剂盒及其检测方法具有非常好的信号-噪声比，所设计的引物和探针具有非常好的特异 性，能准确区分发热伴血小板减少综合征病毒和其它在遗传学上或临床上相关的病毒。通 过对反应条件进行优化，包括引物、探针序列及浓度，Mg2+浓度、反应溫度W及反应时间等， 该试剂盒的检测灵敏度可达到100拷贝分子/反应，可W满足快速检测发热伴血小板减少 综合征病毒的需要。本发明与现有技术相比，其有益效果是：整个核酸扩增和检测过程均不 需要打开PCR管盖，减少了扩增产物污染的机会，反应体系中无外源性染料，不会抑制扩增 反应，同时采用封闭式试纸条对扩增产物进行检测更为客观，避免了样品弱阳型时肉眼观 察染料颜色变化的主观性；采用发热伴血小板减少综合征病毒M基因片段的体外转录产物 作为阳性对照模板，更好地模拟了病毒核酸，能够对病毒检测过程中的核酸逆转录步骤进 行监测，同时，本发明经过临床样本检测的验证，具备较好的临床检测效果。综上所述，本发 明不仅克服了普通PCR和巧光定量PCR对实验环境和实验仪器的依赖，使得发热伴血小板 减少综合征病毒的现场检测成为可能，而且具有检测灵敏度高、特异性强、操作步骤简单、 可重复性高、反应时间短等特性，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0030] 图1为核酸试纸条检测原理图。
[0031] 图2为试剂盒用于发热伴血小板减少综合征病毒检测的敏感性试验结果。
[0032]图3为试剂盒用于发热伴血小板减少综合征病毒检测的特异性试验结果。
【具体实施方式】W33] 实施例一
[0034] 本实施例发热伴血小板减少综合征病毒恒溫扩增检测试剂盒的组成如下： 阳03引①RNA提取试剂：德国Qiagen病毒RNA提取试剂盒（Qia-52904);
[0036]②恒溫扩增反应液：20mMTris-肥 1(抑=8. 8)、10mMKCl、10mM(NH4)2S〇4、6mM M拆〇4、0.l%TritonX-100%、8UBstDNA聚合酶、IOUAMV逆转录酶、IM甜菜碱、IOURNase Inhibitor、dNTPs各0. 8mM、上下游链置换引物各0. 1Ji