水中诺如病毒的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及水体中诺如病毒的检测方法。
【背景技术】
[0002] 诺如病毒为目前国际上报道最重要的非细菌性腹泻病原体，在我国诺如病毒的爆 发也时有报道。但目前国内外对诺如病毒的研究均W人群的粪便和海鲜品标本为主，针对 湖、河等水体中诺如病毒的检测报道较少。诺如病毒在水中虽然比较稳定但无法增值，导 致难W检测。
[0003] 浙江省杭州地区最近几年发生多起诺如病毒爆发疫情，有几起疫情流行病学资料 都把传染源指向水源，但缺乏有效的水源中诺如病毒检测方式使疫情的传染源一直得不到 确认。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种水中诺如病毒的检测方法，具有极高检测 灵敏性和准确度，极大减少取样量，方便检测工作，降低检测成本。 阳〇化]水中诺如病毒的检测方法，其特征在于所述检测方法包括W下步骤：
[0006] (一）第一步浓缩
[0007](1)、取水样SOOna-1000 ml,使用滤纸进行初过滤，去除水样的杂质；
[0008] (2)、过滤后的水样中加入Mg2+,用盐酸调节水样使抑= 3-4;然后采用过滤装置使 水样通过孔径为0. 45ym混合纤维素醋膜；
[0009](3)、将滤过后的混合纤维素醋膜剪碎并随后放入IOml牛肉膏浸出液，超声振荡 洗脱后离屯、，取上清液；
[0010] (二）第二步浓缩
[0011] 将所述上清液分批加入离屯、超滤管进行高速离屯、超滤； 阳012] (S)对经第二步浓缩后的样品进行诺如病毒的检测。
[0013] 本发明提供了一种适合基层使用的简单易行的诺如病毒检测方法。本方法简单高 效，试剂成本比较低，样品量达到数百毫升就可W进行检测，不受水质水量影响，避免了巨 量体积采样而导致的检测实际不可执行的问题，有很高的应用价值，适合基层疾控进行应 用和推广。
[0014] 本发明对诺如病毒的灵敏度为3copy/y1，具有极高的灵敏度，能够完全满足实际 要求。
[0015] 本发明对诺如病毒具有极强的特异性，不浓集病毒W外的物质。
【附图说明】
[0016] 图1为实施例4中的地表水检测巧光PCR检测图谱
[0017] 图2为实施例4中的JV12/JV13PCR扩增电泳图
【具体实施方式】 阳01引实施例1，对水体中诺如病毒的检测
[0019] (一）第一步浓缩（微孔滤膜吸附法）
[0020] 1、对待测水体中取样500ml水样，使用滤纸进行初过滤，本步骤主要去除水样的 杂质，因为病毒颗粒较小，所W能够顺利通过滤纸。 阳〇川 2、过滤后的水样中加入10毫升2. 5mol/L的MgClz,使其终浓度达到0. 05mol/L; 用Imol/L的盐酸调节水样使抑=3. 5 ;然后采用过滤装置使其通过孔径为0. 45ym混合 纤维素醋膜；病毒颗粒在水中带负电荷，阳离子Mg2+和低抑值等条件可W使混合纤维素醋 膜滤膜带正电荷，从而吸附带负电荷的病毒。
[0022] 3、将病毒吸附在滤膜后，将滤过后的混合纤维素醋膜剪碎并随后放入IOml3%的 牛肉膏浸出液，超声振荡洗脱2min(75w，超声时间和间隔时间均为5s)后3000r/min离屯、 15min后取上清液。牛肉膏浸出液为蛋白类物质，它的抑值比较高。在较高的抑值下，在 超声震荡的作用下，可W同病毒竞争吸附位点，从而使膜上的病毒从滤膜洗脱下来并进入 了上清液。
[0023] 经第一步浓缩后，500毫升的水中的病毒被浓缩至10毫升上清液中。病毒回收率 58%左右。
[0024](二）第二步浓缩（超滤法）
[00巧]将10毫升上清液分批加入IOkd离屯、超滤管（规格：4毫升）对进行超滤，过滤条件为3500转离屯、12min，浓缩后的体积为1. 5ml左右。离屯、超滤管有一个类似于内管和外 管的两个部分，内管中是带有一定分子量的膜，当高速离屯、时，分子量比它小的就漏到下面 的管子（即外管）中了，分子量比它大的就截留在上面（即内管中）。通过第二步浓缩进一 步提高病毒浓缩效率。 阳0%] (S)对浓缩至1. 5ml的样品采用巧光定量RT-PCR方法、普通RT-PCR方法、酶联 免疫吸附测定巧LISA)等方法检测诺如病毒。
[0027] 实施例2,灵敏性试验
[0028] 对诺如病毒模拟样品使用微孔滤膜吸附法进行过滤，对其产物使用超滤法进行第 二次浓缩（方法同实施例1)。每个样本浓度相差10倍，计算浓缩的回收率。对诺如病毒模拟 样品使用巧光定量技术计算方法的检测灵敏度，本发明对诺如病毒浓缩的灵敏度为3copy/ y1，具体见表1。
[0029] 表1两步浓缩法对诺如病毒浓缩的灵敏度分析（浓度单位：copy/ y 1)
[0030]
[0031] 实施例3本发明两步浓缩法同传统浓缩方法的比较
[0032] 根据文献选取氯化侣絮凝沉淀法、改良氯化巧吸附过滤法两种常见的水中病毒浓 缩方法同本方法进行比较。在水中接种诺如病毒作为模拟样品，浓缩前和浓缩后都进行巧 光定量PCR检测病毒浓度，并计算病毒回收率，结果显示本发明的两步浓缩法病毒回收率 最高，结果见表2。
[0033] 表2 =种病毒浓缩方法病毒回收率比较（浓度单位：copy/y1)
[0034]
阳035] 实施例4本发明两步浓缩法的应用
[0036] 对浙江省余杭区临平镇、乔司镇和塘栖镇=个地方的地表水进行采样，共采集样 品32个，每个样品500ml。应用实施例1的方法对水样进行浓缩，浓缩的样品应用巧光 RT-PCR方法进行诺如病毒检测，检测结果见图1。诺如病毒巧光RT-PCR阳性样品使用两套 普通PCR引物（C0G2F/C0G2R和JV12/JV13)进行普通RT-PCR方法检测（见图2)，然后送上 海吉美生物工程有限公司进行测序。32个样品有12个样品诺如病毒GII型检测阳性，阳性 率37.5% ;测序结果进行比对后证实为诺如病毒。
[0037] 在取上述样品的同时，在取每个样品的同时再取相同的样品2份，且体积均为 1000ml，获得32个1000 ml的样品两套，分别用氯化侣絮凝沉淀法、改良氯化巧吸附过滤法 运两种传统浓缩方法浓缩，再采用巧光RT-PCR方法进行检侧，无诺如病毒检出。
[0038] 证明本发明检测的高准确性和高灵敏性。
【主权项】
1.水中诺如病毒的检测方法，其特征在于所述检测方法包括以下步骤： (一） 第一步浓缩 (1) 、取水样250ml-1000ml，使用滤纸进行初过滤，去除水样的杂质； (2)、过滤后的水样中加入Mg2+，用盐酸调节水样使pH = 3-4;然后采用过滤装置使水样 通过孔径为0. 45 y m混合纤维素酯膜； (3) 、将滤过后的混合纤维素酯膜剪碎并随后放入IOml牛肉膏浸出液，超声振荡洗脱 后离心，取上清液； (二） 第二步浓缩 将所述上清液分批加入离心超滤管进行高速离心超滤； (三） 对经第二步浓缩后的样品进行诺如病毒的检测。
【专利摘要】本发明提供了一种水中诺如病毒的检测方法，它对样品经混合纤维素酯膜过滤浓缩、将滤过后的硝酸纤维素膜剪碎并随后放入10ml牛肉膏浸出液，超声振荡洗脱后离心，取上清液，将所述上清液分批加入离心超滤管进行高速离心超滤；然后再进行诺如病毒的检测。本发明具有极高检测灵敏性和准确度，极大减少取样量，方便检测工作，降低检测成本。
【IPC分类】C12Q1/70, C12R1/93, G01N33/569, C12Q1/24, C12Q1/68
【公开号】CN105154587
【申请号】CN201510552892
【发明人】宋士利
【申请人】杭州市余杭区疾病预防控制中心
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月2日