低-磷酸盐可阻遏的启动子的制作方法
【专利说明】低-磯酸盐可阻遏的启动子
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2013年3月14日提交的美国临时专利申请序列号61/783, 641的 优先权，为了所有的目的通过引用W其全部内容并入本文。
[0003] 对"序列表"、表格、或作为ASCII文件提交的计算机程序列表附件的引用
[0004] 通过引用将W文件CX5-130W01_ST25.TXT书写的序列表在此并入本文，所述文件 创建于2014年3月11日，32, 178字节，机器版本IBM-PC，MS-Windows操作系统。 发明领域
[0005] 本发明提供了包含低-憐酸盐可阻遏的启动子的组合物和方法。特别地，本发明 提供了来自大肠杆菌巧.coli)的低-憐酸盐可阻遏的启动子。
[000引发明背景
[0007] 多种细菌的表达控制DNA序列已被经转化的细菌用来控制外来的（即，异源的） 多核巧酸的表达，W及控制同源基因的表达。事实上，近几年来随着遗传工程的发展，利 用多种生物体作为宿主细胞来产生经济上期望的量的蛋白质已经成为可能。由于大肠杆 菌巧.coli)具有约20分钟的短的生殖周期且可W利用多种糖来繁殖，在蛋白质生产系统 中其被广泛地用作宿主细胞。此外，可用于大肠杆菌的大量质粒载体已被开发。已经用宿 主-载体系统实现了重组蛋白的快速且稳定的工业生产，其中所述宿主-载体系统采用大 肠杆菌作为宿主细胞。尽管如此，对于较好的控制细菌基因表达仍有需求，特别是在商业化 生产过程系统中。
[000引发明概述
[0009] 本发明提供了包含低-憐酸盐可阻遏的启动子的组合物和方法。特别地，本发明 提供了来自大肠杆菌的低-憐酸盐可阻遏的启动子。在一些实施方案中，本发明提供了用 于通过如本文提供的低-憐酸盐可阻遏的启动子的调节作用，控制感兴趣的至少一种产物 的表达的方法。事实上，意图本发明在感兴趣的基因的选择性表达中提供优势。在一些实施 方案中，如期望的，本发明提供了在微生物培养物的生长期间，使某些基因的表达沉默（也 就是，"关闭"）的工具。
[0010] 本发明提供了包括期望的表型的重组微生物，其中通过使微生物暴露至有限的憐 酸盐浓度的条件来获得期望的表型。在一些实施方案中，微生物的基因组包括改变微生物 的憐酸盐敏感性的至少一个突变。在一些另外的实施方案中，微生物在psts中包括至少一 个突变。在一些另外的实施方案中，pstS突变选自T10M、T10Y、D56S和/或T139H。在一 些另外的实施方案中，pstS突变选自T10M、T10Y、D56S和/或T139H，其中氨基酸位置参考 SEQIDN0:3被编号。在一些仍然另外的实施方案中，在培养基内存在重组微生物并且通过 在至少一个异源调控序列的控制下表达至少一个基因来获得期望的表型且所述异源调控 序列响应于培养基的憐酸盐浓度。在一些实施方案中，微生物包括化〇1和/或化〇17启动 子。在一些实施方案中，重组微生物包括SEQIDNO:4所列的化〇1序列。在一些另外的实 施方案中，重组微生物包括SEQIDNO: 5所列的化〇17序列。在一些另外的实施方案中，重 组微生物包括560 10^:4所列的化〇1序列和/或560 10^:5所列的化〇17序列。在 仍然一些另外的实施方案中，微生物是大肠杆菌。
[0011] 本发明还提供了用于产生至少一种异源多肤的方法，所述方法包括在包含低浓度 的憐酸盐的培养基中培养包含编码至少一种异源多肤的至少一种多核巧酸序列的重组微 生物，W使得至少一种多核巧酸被表达并产生至少一种异源多肤。在一些实施方案中，至少 一种异源多肤由异源基因编码，其中所述异源基因在基因的调控区中包含至少一个突变。 在一些实施方案中，所述方法还包括回收至少一种多肤的步骤。在一些实施方案中，重组微 生物在psts中包含至少一个突变。在一些另外的实施方案中，psts突变选自T10M、T10Y、 D56S和/或T139H。在一些另外的实施方案中，pstS突变选自T10M、T10Y、D56S和/或 T139H，其中氨基酸位置参考SEQIDN0:3被编号。在一些另外的实施方案中，重组微生物 包含化〇1和/或化〇17启动子。在一些实施方案中，重组微生物包括SEQIDN0:4所列 的化〇1序列。在一些另外的实施方案中，重组微生物包含SEQIDNO: 5所列的的化〇17序 列。在仍然一些另外的实施方案中，重组微生物包含SEQIDNO:4所列的化〇1序列和SEQ IDN0:5所列的化〇17序列。在一些实施方案中，微生物是大肠杆菌。在一些另外的实施方 案中，与不包含至少一个可阻遏的启动子的重组微生物相比，重组微生物产生增加的产量 的至少一种异源多肤。在一些另外的实施方案中，与不包含可阻遏的启动子的重组微生物 相比，重组微生物产生增加的产量的至少一种产物。在一些实施方案中，产物包括至少一种 醇。在一些另外的实施方案中，至少一种异源多肤选自真核多肤和原核多肤。
[0012] 本发明还提供了包含化〇1的低-憐酸盐可阻遏的启动子。在一些实施方案中， 化〇1启动子包含SEQIDN0:4。在一些另外的实施方案中，本发明还提供了包含化〇17的 低-憐酸盐可阻遏的启动子。在一些实施方案中，Phol7启动子包含SEQIDN0:5。
[0013] 本发明还提供了包含至少一种低-憐酸盐可阻遏的启动子的表达构建体。在一些 实施方案中，表达构建体包括化〇1启动子和/或化〇17启动子。在一些另外的实施方案 中，化〇1启动子包含SEQIDN0:4。在一些另外的实施方案中，Phol7启动子包含SEQID N0:5。
[0014] 本发明还提供了包含至少一种低-憐酸盐可阻遏的启动子的重组宿主细胞，其中 所述启动子为低-憐酸盐可阻遏的启动子化〇1和/或化〇17。在一些另外的实施方案中， 化〇1启动子包含560 10^:4。在一些另外的实施方案中，？11〇17启动子包含560 10^:5。 在一些实施方案中，宿主细胞表现出期望的表型。
[0015] 附图简述
[001引图1提供了启动子化ol(SEQIDN0:4)和化ol7(SEQIDN0:w的部分DNA序列。 在该图中，根据Diniz等人值iniz等人，J.Bact. 193:6929-6938[2011])，箭头指示Pho框 的定位和方向。斜体字显示了化〇17中改变的碱基。还指示了启动子的-35和-10区。 [0017]图2提供了显示如在实施例2中描述的卡那霉素-Phol启动子盒的结构的示意 图。
[001引发明描述
[0019] 基因表达的适当控制对于经济上可行的生物技术商业化过程的发展来说是必要 的。主要的考虑是需要细胞机器W过度产生大量的商业上相关的一种并且往往多于一种产 物。但是，在正常情况下，细胞利用多种机制，所述多种机制避免细胞所不需要的任何分子 的过度生产。运些机制之一是通过控制转录启动子的活性实现的基因表达的严紧调控。转 录启动子（本文称为"启动子"）是于该处RNA聚合酶结合，W起始DNA转录，从而产生能够 执行生物学功能的RNA的染色体区域。启动子活性通过增强或减少启动子驱动RNA产生的 能力的激活和/或阻遏机制来控制。在利用大肠杆菌作为生产宿主的大多数生物技术过程 中，通常使用强启动子。运些启动子通常通过抑制RNA聚合酶与启动子的生产性相互作用 的阻遏物的结合来控制。
[0020] 在大肠杆菌和其他细菌中最广泛使用的启动子系统是乳糖启动子（Plac)及其阻 遏物LacI。该系统通常在实验室中通过添加安慰诱导物异丙基-P-D-硫代半乳糖巧酶 (IPTG)来诱导。大肠杆菌中的另一种常见的表达系统源自化oA启动子和PstS启动子，所 述表达系统仅在生长培养基中的憐酸盐（Pi)的水平低时，被化oB蛋白质激活。憐酸盐作 为调苄基因表达的方式的应用是特别有用的，因为憐酸盐通常被添加到大多数生长培养基 中，且其水平可容易地被控制。在很多细菌中，含憐化合物的同化作用取决于细胞外的Pi 浓度并且基于由双组分调控系统控制的传感机制。在大肠杆菌和一些其他物种中，所述系 统由地oB和地oR基因编码。地oR是监控憐酸盐的细胞外可用性的传感器组氨酸激酶， 而化oB是控制基因表达的响应调控因子。大肠杆菌对低-憐酸盐条件的响应设及化oR 自身憐酸化和Pi到化oB的转移。憐酸化的化oB(PhoB~Pi)W比非憐酸化的化oB高的 亲和力与DNA结合并发挥其对基因表达的调控功能。在大肠杆菌中，化oB~Pi通过与位 于Pho调节子基因的启动子的上游的被称为"Pho"框"的保守的18-bpDNA序列结合，激 活多于40个基因（即，Pho调节子）的表达（参见例如，化sieh和Wanner,化rr.化in. Microbiol.，13:198-203巧010])。大肠杆菌共有Pho框CT(G或T)TCATA(A或T)A(A或 T)CTGTCA灯或C)(SEQIDN0:1)由通过保守的4-bpAT富集的间隔序列分隔开的两个 7-bp定向重复组成（参见，Blanco等人，St;ruc1:ure10:701-713 [2002];和Diniz等人， J.Bact.，193:6929-6938巧011])。
[0021] 如本文描述的，当需要关闭基因（例如，因为其产物不是所需要的）和/或基因产 物的存在干扰期望的产物的过度生产时，低-憐酸盐可阻遏的启动子的应用是有用的。事 实上，如本文描述的，本发明提供了可W通过低憐酸盐条件阻遏的用于大肠杆菌的新的启 动子系统。
[0022] 在一些另外的实施方案中，宿主细胞的憐酸盐传感器机制被改进。尽管并非意图 本发明限于任何特定的机制，但是大肠杆菌的PstS传感器的憐酸盐-结合口袋中的突变可 W影响其对憐酸盐的亲和力并且结果是影响传感器机制的敏感性（参见例如，美国专利号 5, 304, 472;Yao等人；Biochem.，35:2079-2085 [1996])。在内源性大肠杆菌pstS基因中 引入突变的任何合适的方法在本发明中具备实用性，所述合适的方法包含但不限于如本文 描述的利用AR邸重组工程技术的寡核巧酸定点诱变。在一些另外的实施方案中，参与无 机憐酸盐传感机制的一个或更多个基因（例如，phoB、地oR、phoU、pstsA、ps1:B、pstC、和/ 或pst巧中的突变在改变利用本发明产生的宿主菌株的憐酸盐敏感性中具备实用性。并非 意图本发明限于任何特定基因中的任何特定突变，也不意图本发明限于任何特定的培养条 件。在一些实施方案中，宿主菌株是大肠杆菌。事实上，意图本发明在通过包含本发明的至 少一个憐酸盐-可阻遏的启动子的细菌产生任何合适的异源多肤中具备实用性。
[0023] 帝义:
[0024]除非另外定义，本文使用的所有技术术语和科学术语通常具有与本发明所属于的 领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。通常，本文使用的命名法和W下描述的细 胞培养、分子遗传学、微生物学、有机化学、分析化学、和核酸化学的实验室程序是本领域公 知且被通常地采用的。此类技术是公知的并被描述于本领域的技术人员熟知的许多文本和 参考著作中。将本文前文和下文两者提到的所有专利、专利申请、文章和出版物在此通过引 用明确地并入本文。
[0025] 尽管与本文描述的那些相似或等价的任何合适的方法和材料在本发明的实践中 具备实用性，本文描述了一些方法和材料。要理解本发明不限于所描述的特定方法论、方案 和试剂，因为取决于本领域技术人员使用其的上下文，运些可W改变。因此，W下紧接着定 义的术语通过参考本申请整体被更充分地描述。
[0026] 同样，如本文使用的，除非上下文另外明确指出，术语"一个（a)"、" 一种（an)"和 "该（the)"包括复数指代物。数值范围包括定义该范围的数字。因此，本文公开的每个数 值范围意图包括落在此类较宽的数值范围的每个较窄的数值范围，如同在本文中此类较窄 的数值范围被全部明确地写出。还意图本文公开的每个最大的（或最小的）数值限制包含 每个较低（或较高）的数值限制，如同在本文中此类较低（或较高）数值限制被明确地写 出。此外，本文提供的标题并不是可通过参考本申请整体得到的本发明的多个方面或实施 方案的限制。尽管如此，为了利于本发明的理解，W下定义了许多术语。除非另外指出，分 别从左到右W5'到3'的方向书写核酸；从左到右W氨基到簇基的方向书写氨基酸序列。
[0027] 如本文使用的，术语"包括（comprising)"及其同根词W其包含性含义被使用 (即，等价于术语"包含（including)"及其相应的同根词）。
[0028] 如本文使用的，术语"憐酸盐消耗"指与培养基中常规使用的憐酸盐浓度相比，培 养基中憐酸盐的显著减少。如本领域已知的，取决于使用的大肠杆菌菌株、接种量、初始憐 酸盐浓度和生长培养基的抑，当憐酸盐浓度低于大约50微摩尔时，化oB-PhoR系统被诱 导（参见例如，Lubke等人，E；nz.Microb.Technol.，17 :923-928[199引）。然而，还已知，在 一些条件下，当憐酸盐浓度小于大约4微摩尔时，获得最大的诱导（参见例如，化sieh和 Wanner,同上）。因而，并非意图本发明限于任何特定的初始或过程中产生的憐酸盐浓度、特 定细菌菌株、或其他生长条件。本领域技术人员明白如何改变条件，W使所使用的菌株的性 能最佳化。
[0029] 如本文使用的，"憐酸盐结合区域"是与憐酸盐结合的蛋白质区域。
[0030] 如本文使用的，大肠杆菌叩Sts蛋白质"指由细菌细胞中的"PstS基因"编码的蛋 白质，所述细菌细胞包含但不限于肠杆菌科（例如，大肠杆菌）。在一些实施方案中，大肠杆 菌PstS分别地包含W下多肤和多核巧酸序列：
[0034]如本文使用的酶变体"和"变异酶"，包括"PstS变体"，用于指与参考酶相似（尤 其在它们的功能上），但是在其氨基酸序列中具有突变使其在序列上不同于野生型或另一 种参考酶的酶。可W通过本领域技术人员熟知的很多种不同的诱变技术制备酶变体。另 夕F，诱变试剂盒也是从很多商业的分子生物学供应商可得的。对于在限定的氨基酸上形成 特定的取代（定点）、在基因的局部区域中形成特定的或随机的突变（区域特定的）或在整 个基因上形成随机诱变（例如，饱和诱变），方法是可得的。本领域的技术人员已知形成酶 变体的许多合适的方法，包含但不限于利用PCR的单链DNA或双链DNA的定点诱变、盒式诱 变、基因合成、易错PCR、重排、和化学饱和诱变或本领域已知的任何其他合适方法。在产生 变体之后，可针对任何合适的期望的特性对其筛选。
[003引如本文使用的，术语"启动子"指转录启动子（即，指导多核巧酸的转录的序列）。
[0036] 如本文使用的，"启动子序列"是被宿主细胞识别，用于编码区的表达的核酸序列。 控制序列可W包含适当的启动子序列。启动子序列包含介导多肤的表达的转录控制序列。 启动子可W是在所选的宿主细胞内显示转录活性的任何核酸序列，包括突变的启动子、截 短的启动子、和杂合启动子，并且可W从编码宿主细胞内源性或异源性的细胞外或细胞内 多肤的基因获得。
[0037] 如本文使用的，"细菌启动子"指能够起始细菌细胞内的转录的启动子。在一些实 施方案中，启动子能够调节至少一个多核巧酸的转录。在一些实施方案中，细菌启动子是大 肠杆菌启动子。
[0038] 如本文使用的，"可阻遏的启动子"是在某些条件下表现出降低的发挥功能的能力 的启动子。
[0039] 如本文使用的，"憐酸盐-调节的启动子"是转录启动子，其中启动子发挥功能的能 力通过用于培养启动子居于其中的细胞的生长培养基中的憐酸盐水平来调节。
[0040] 如本文使用的，"憐酸盐敏感性"指培养基中的憐酸盐对憐酸盐-调节的启动子的 影响。在一些实施方案中，启动子对憐酸盐浓度相对不敏感（即，憐酸盐浓度对启动子的活 性没有影响），而在一些其他的实施方案中，启动子对憐酸盐浓度非常敏感（即，憐酸盐浓 度极大地影响启动子的活性）。
[0041]如本文使用的低-憐酸盐可阻遏的启动子"是转录启动子，其中与在其中用于培 养包含启动子的细菌的生长培养基中（如在通常用于培养细菌的生长培养基中）的憐酸盐 处于高浓度的条件下启动子的功能性能力相比，在低-憐酸盐条件下启动子发挥功能的能 力降低。
[0042]如本文使用的，术语"低-憐酸盐条件"指生长培养基中的憐酸盐浓度低于大约50 微摩尔。
[0043]如本文使用的，术语"诱导型启动子"指转录启动子，其中启动子有效地发挥功能 的能力需要化学或物理因子的存在或不存在。因而，在一些实施方案中，诱导型启动子的活 性受某些条件（例如，光、溫度、化学浓度、蛋白质浓度等）的影响。
[0044]如本文使用的，术语"组成型启动子"指在大多数，但是不一定所有的环境条件和 /或细胞发育和/或分化的状态下，积极促进转录的启动子。
[0045]如本文使用的，"任选的启动子片段"指对于驱动可操作地连接的编码区所不需要 的启动子的任何子序列。在一些实施方案中，运些片段包括5'UTR(即，5'非翻译区），W及 内源性编码区的任何外显子。在一些另外的实施方案中，任选的启动子片段包括任何外显 子和存在于启动子的上游（即，启动子的5'）的基因的3'或5'。术语还包括任何位于中 间的序列（旨P，内含子），W及存在于外显子之间或外显子和UTR之间的序列。
[0046]如本文使用的，术语"优先转录"指响应于特定的刺激（例如，低的或高的憐酸盐 浓度）发生的转录。可W通过测量起始、速率和/或转录水平评价优先转录。
[0047]如本文使用的，术语"调节转录"指启动子序列影响转录起始、转录的速率和/或 转录水平，W及任何其他相关的生物活性的上调和下调的活性。
[0048]如本文使用的，术语"转录起始位点"指在多核巧酸上起始转录的点。
[0049]如本文使用的，术语"表型"指菌株的可观察的特征。运些特征由菌株的基因的表 达，W及环境因素的影响和两者之间的相互作用引起。表型的实例包括但不限于特定的一 组条件下菌株的生长速率；菌株利用葡萄糖作为碳源的能力；和/或菌株在低-憐酸盐生 长条件下表达某些基因的能力。
[0050]如本文使用的，"期望的表型"是通过菌株的至少一个遗传修饰获得的特定表型。 因而，期望的表型不同于遗传修饰之前的菌株的表型。例如，在一些实施方案中，起始（即， 亲本）菌株能够在低憐酸盐条件下表达某些基因并且期望的表型是在相同的生长条件下 不能表达此类基因的菌株。在一些另外的实施方案中，亲本菌株能够在高憐酸盐条件下表 达某些基因并且期望的表型是在相同的生长条件下不能表达此类基因的菌株。
[0051]如本文使用的，"途径"指参与引起产物和/或活性的产生的至少两个连续的相互 作用的一组系统组分。术语包括多种途径类型，包括但不限于生物化学途径、基因表达途 径、调控途径、和/或运些示例性途径类型的组合。
[0052]如本文使用的，术语"公共序列"指在可公开访问的数据库中储存的任何序列。术 语包括氨基酸和核巧酸序列。可公开访问的数据库的实例包括但不限于NCBIFTP网站、 GenBank、EuropeanBioinformaticsInstitue巧BI-EMBL)、DNADatebaseofJapan(DBBJ) 和化ooWiavenProteinDataBank(PDB)、W及与专利局（例如