提高l-半胱氨酸生产能力的属于肠杆菌科的细菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种在硫酸盐存在下提高k半脫氨酸生产能力的属于肠杆菌科的细 菌、W及使用该细菌制造k半脫氨酸的方法。
【背景技术】
[0002] 半脫氨酸、脫氨酸类被广泛应用于医药品、化妆品、食品等多个领域。由于半脫氨 酸是主要由人类和动物的毛发较多含有的氨基酸，因此过去是通过水解运些毛发来制造半 脫氨酸。然而从进一步提高产品的安全性W及减少对环境影响的观点出发，人们期待与其 他很多氨基酸相同的发酵法进行制造。
[0003] 目前已报告了多种通过使用属于肠杆菌科的细菌的发酵法制造半脫氨酸的方法 (专利文献1和2)。对于属于肠杆菌科的细菌，如大肠杆菌，作为生物合成半脫氨酸的途径 存在两种途径，即硫酸盐作为硫源使用的途径（硫酸途径）和硫代硫酸盐作为硫源使用的 途径（硫代硫酸途径）（非专利文献1)。
[0004] 已知使用属于肠杆菌科的细菌制造半脫氨酸时，一般作为硫源使用仅包含硫酸盐 的培养基也不能有效制造半脫氨酸，但是作为硫源使用硫酸盐的基础上还包含硫代硫酸盐 的培养基，则更有效制造半脫氨酸。 阳〇化]然而作为硫源使用的硫代硫酸盐，相比于硫酸盐非常昂贵。因此人们寻求研发出 作为硫源使用廉价的硫酸盐且有效制造半脫氨酸的方法。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献 1 :W02009/104731
[0009] 专利文献2 :特开2010-193788号公报
[0010] 非专利文献
[0011] 非专利文献 1:Nakatanietal. ,(Enhancementofthioredoxin/ glutaredoxin-mediatedL-cysteinesynthesisfromS-sulfocysteineincreases L-cysteineproductioninEscherichiacolo',MicrobialCellFactories, 2012, 11:62
【发明内容】
[0012] 本发明的目的在于提供一种在硫酸盐存在下提高k半脫氨酸生产能力的属于肠 杆菌科的细菌、W及使用该细菌廉价且有效地制造k半脫氨酸的方法。
[0013] 本发明人经过深入研究发现，0-乙酷丝氨酸硫化氨解酶B缺乏且硫代硫酸结合蛋 白质的C末端区域缺失的大肠杆菌突变株在仅含硫酸盐作为硫源的培养基中也发挥很高 的k半脫氨酸生产能力。基于运些认识进一步研究后完成了本发明。
[0014] 目P，本发明包含W下方面。
[0015] 项1、一种属于肠杆菌科的细菌，所述属于肠杆菌科的细菌被改造W降低0-乙酷 丝氨酸硫化氨解酶B的活性，其特征在于，
[0016] 所述属于肠杆菌科的细菌被改造，w使硫代硫酸结合蛋白质的C末端区域缺失， 且在硫酸盐存在下提高k半脫氨酸生产能力。
[0017] 项2、根据项1所述的细菌，其特征在于，所述硫代硫酸结合蛋白质是下述（a)或 化）中记载的蛋白质： 阳01引 （a)由序列号1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者
[0019] 化）由与序列号1所示的氨基酸序列具有85%W上同一性的氨基酸序列组成，且 具有硫代硫酸结合活性的蛋白质。
[0020] 项3、根据项2所述的细菌，其特征在于，所述C末端区域是下述（C)或（d)中记载 的区域：
[0021] (C)包含由序列号1所示的氨基酸序列中第274~300位的氨基酸组成的区域的 区域；或者
[0022] (d)在与序列号1所示的氨基酸序列具有85%W上同一性的氨基酸序列中，与包 含由序列号1所示的氨基酸序列中第274~300位的氨基酸组成的区域的区域相对应的区 域。
[002引项4、根据项1~3中任一项所述的细菌，其特征在于，所述0-乙酷丝氨酸硫化氨 解酶B是下述（e)或（f)中记载的蛋白质：
[0024] (e)由序列号3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者
[00巧](f)由与序列号3所示的氨基酸序列具有85%W上同一性的氨基酸序列组成，且 具有0-乙酷丝氨酸硫化氨解酶B活性的蛋白质。
[0026] 项5、根据项1~4中任一项所述的细菌，其特征在于，对所述0-乙酷丝氨酸硫化 氨解酶B编码的基因被破坏。
[0027] 项6、根据项1~5中任一项所述的细菌，其特征在于，所述属于肠杆菌科的细菌是 埃希氏菌属细菌。
[0028] 项7、一种k半脫氨酸的制造方法，其特征在于，从培养基中培养权利要求1~6 中任一项所述的细菌所得的培养物中采集k半脫氨酸。
[0029] 项8、根据项7所述的制造方法，所述培养基包含硫酸盐作为硫源。
[0030] 项9、根据项8所述的制造方法，所述培养基还包含硫代硫酸盐作为硫源。
[00川发明效果
[0032] 根据本发明，能够提供一种在硫酸盐存在下提高k半脫氨酸生产能力的属于肠 杆菌科的细菌。通过使用该细菌，即使是仅含硫酸盐作为硫源的培养基，也能很有效地制 造k半脫氨酸。由于硫酸盐相比硫代硫酸盐非常廉价，因此该制造方法在成本方面优异。 此外，在作为硫源除硫酸盐外还包含硫代硫酸盐的培养基中培养，从而能够更高效地制造 k半脫氨酸。由于本发明的制造方法使用微生物发酵，因此从所得产品的安全性或环境影 响的观点出发，也是优异的方法。
【附图说明】
[0033] 图1是表示半脫氨酸的生物合成途径的示意图；
[0034] 图2表示由硫代硫酸盐阻碍（硫代硫酸阻遏）W硫酸途径进行的半脫氨酸生物合 成；
[0035] 图3表示不发生硫代硫酸阻遏的突变株（抑制基因突变株）的增殖曲线；
[0036] 图4表示仅含硫酸盐作为硫源的培养基中的抑制基因突变株的半脫氨酸生产能 力；
[0037] 图5表示除硫酸盐外还包含硫代硫酸盐作为硫源的培养基中的抑制基因突变株 的半脫氨酸生产能力。 具体实施例
[0038] 1、细荫
[0039] 本发明设及一种属于肠杆菌科的细菌，为被改造W降低0-乙酷丝氨酸硫化氨解 酶B活性的属于肠杆菌科的细菌，其特征在于，所述属于肠杆菌科的细菌被改造W使硫代 硫酸结合蛋白质的C末端区域缺失，且在硫酸盐存在下提高k半脫氨酸生产能力。
[0040] 没有特别限定属于肠杆菌科的细菌，只要具有k半脫氨酸生产能力，可W是野生 株，也可W是改造株。在运里，本发明中的k半脫氨酸生产能力是指在含有硫源的培养基 中培养时，在培养基中积累心半脫氨酸的能力。具体地，可列举国家生物技术信息中屯、 (NCBI:化tionalCenterforBiotechnologyInformation)数据库中记载的按分类属于 肠杆菌科的埃希氏菌属细菌、肠杆菌属细菌、泛菌属细菌、克雷伯氏菌属细菌、沙雷氏菌属 细菌，欧文氏菌属细菌，沙口氏菌属细菌，摩根氏菌属细菌等、W及运些细菌的改造株（或 突变株）化ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/T曰xonomy/Browser/wwwt曰X.cgi?id= 91347)， 优选可列举埃希氏菌属细菌及其改造株（或突变株）。
[0041] 没有特别限定埃希氏菌属细菌，具体可使用奈德哈特（Nei化ar化）等人的著作 (Backmann,B.J. 1996.DerivationsandGenotypesofsomemutantderivativesof EscherichiacoliK-12,p. 2460-2488.Table1.InF.D.Neidhardt(ed.),Escherichia coliandSalmonellaCellularandMolecularBiology/SecondEdition,American SocietyforMicrobiologyPress,Washington,D.C.)中列举的埃希氏菌属细菌。其中， 列举有大肠杆菌。大肠杆菌具体可列举来自原形野生株K12株的大肠杆菌W3110(ATCC 27325)、大肠杆菌MG1655(ATCC47076)等。
[0042] 属于肠杆菌科的细菌的改造株中，优选进行改造W增强k半脫氨酸生产能力。可 根据公知的方法进行运种改造。
[0043] 对于细菌增强k半脫氨酸生产能力时，可应用现有的育种棒状杆菌细菌或埃希 氏菌属细菌等时采用的方法，例如，获取营养缺陷型突变株、类似物抗性株、代谢调控突变 株、或创制k半脫氨酸的生物合成基酶的表达增强的重组菌株等（参照氨基酸发酵，学会 出版中屯、有限公司，1986年5月30日初版发行，第77~100页）。在运里，在k半脫氨酸 生产菌的育种中所提供的营养缺陷型、类似物抗性、代谢调控突变等性质可W是一种，也可 W是两种或S种W上。此外，表达增强的k半脫氨酸生物合成基酶也可W是一种，还可W 是两种或=种W上。进一步地，还可W将提供营养缺陷型、类似物抗性、代谢调控突变等性 质与生物合成基酶增强组合。
[0044] 对于获取具有k半脫氨酸生产能力的营养