改进复合基质中微生物的分析的方法

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改进复合基质中微生物的分析的方法
【专利说明】改进复合基质中微生物的分析的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年3月13日提交的美国临时专利申请号61/779,766的申请日 的权益,并且设及2012年4月5日提交的美国临时申请号61/620,823,其与本申请共同拥 有,其公开内容通过引用由此并入本文。 阳00引发明背景
[0004] 确定特定样品中活的生物的同一性和总数目是非常重要的。其具体的重要性是通 过快速、高效和准确地监控和鉴定食物中和环境中的致病生物,进而监测和确保食物和水 供应的安全。 阳0化]实现此的一个运样的方法是总存活生物灯V0)测定(totalvi油ilityorganism assay)。TVO测定如今作为质量控制应用广泛用于工业微生物领域。例如,TVO测定用于监 测消费食物产品比如肉中的细菌的数目和类型。TV0方法还可用于监测饮用水中的细菌群 体。当然,监测食物和水对确保食物和水供应的安全消费是至关重要的。
[0006]TV0测定的步骤一般包括:1)获得试样讯。在置于合适容器中的琼脂(凝胶状 营养物质)上培养或平板接种。使微生物生长并基于在琼脂上形成的菌落的数目计算菌落 形成单位(CRJ)。仅可在为菌落生长留出时间后计算CRJ。样品通常被稀释,并且当计算 C即时考虑此稀释因子(即,样品与总体积的体积比)。
[0007] 还可W在各种琼脂平板上培养样品,所述琼脂平板包含不同类型的选择性培养基 W帮助分离目标微生物,并且更精确和可靠地确定存在哪种类型的微生物。选择性试剂 (例如,抗生素、抗真菌剂等)将消灭某些非目标微生物(例如,不感兴趣的细菌)。运避免 了如果形成来自许多不同类型的微生物的菌落可能出现的假结果的可能性。
[0008] 选择性试剂还可W相对于其它类型利于某些类型的微生物的生长。虽然TV0测定 允许检测不同的微生物物种,例如不同的细菌物种,但是食品和环境微生物学家通常必须 在计数和鉴定之间选择,而不能选择二者。虽然选择性试剂可被添加W利于特定类群生物 的生长,但是TV0测定通常基于正常健康细胞在富营养培养基中繁殖的能力(即,不进行选 择)。因此,TV0具有测量待测样品中的微生物或一类群微生物的总数目的能力。然而,因 为缺少区分特定微生物的能力,TV0对作为整体的微生物群体可W是相对非特异性的。
[0009] 存在鉴定特定微生物,尤其是病原体的可用的众多其它方法。运样的方法广泛地 用于临床环境。用于检测微生物的方法通常取决于微生物培养的富集W增大目标微生物的 数目和允许回生损伤的微生物。当采用选择性和鉴别平板接种时,研究者能够将目标生物 与背景微生物群落区分开。然而,结果几乎总是非计数性的。换句话说,仅可W确定特定细 菌群体的存在与否,而不能定量。
[0010] 利用样品富集和选择性平板接种结果二者是耗时的测定,其通常甚至在可获得初 步结果前花费数天。虽然运样的富集和选择性平板接种是确定样品中微生物的数目和类型 的主要过程,但是它通常可花费数天W在对琼脂上生长的菌落计数后获得最终结果。获得 结果所花费的时间量是使用主要的TV0测定的最显著的缺点。
[0011] 已经开发了不同的方法,其试图通过消除选择性和鉴别平板接种步骤缩短检测时 间。运样的方法包括DM杂交、凝集和酶免疫测定。虽然运些可选技术已经缩短了检测时 间,但是培养富集步骤依然必要,因为运些方法仅允许1〇3-1〇4CRJ的目标病原体的最终检 巧。。因此,假定阳性结果的确认依然需要TVO测定。
[0012] 此外,不存在可用于分析生物样品,尤其是食物样品的通用方法或单个技术,W检 测多种微生物存在与否。运使得在测定微生物之前用于分离和随后浓缩来自生物样品的微 生物的样品制备步骤成为用于检测病原体的分子方法中的限速步骤,所述病原体包括食物 传染的病原体。
[0013] 对于分离微生物的具体样品制备技术,利用离屯、然后是冲洗和过滤步骤的技术是 没有优势的,因为它们在处理期间导致微生物的显著损失或损伤微生物。此外,整个过程是 不可W是自动化处理的。
[0014] 为了实现从样品分离微生物,已经采用用于特定微生物的亲和试剂。然而,用于从 复合基质分离微生物的亲和试剂也是复杂而难W运用的,因为:1)缺少结合至选择性地来 自其它样品成分的所有生物的通用亲和试剂;2)不同生物结合至通用亲和试剂的亲和力 可变性;和3)将结合的生物洗脱回溶液的困难。
[0015] 用于鉴定食物和水中病原体的其它技术也是已知的。例如,已经报道了流 式细胞术作为计数和鉴定微生物的快速技术。流式细胞术是最初用于分离和分析真 核细胞群体的方法,但也已经被用于评估和检测微生物。具体而言,已经被巧光染色 的微生物穿过光束。通过光吸收和散射二者的组合,获得感兴趣的微生物独有的图 案度reeuwer等人,Characterizationofuptakeandhydrolysisoffluorescein di曰cet曰te曰ndc曰rboxyfluoresceindi曰cet曰tebyintr曰cellul曰rester曰sesin S.cerevisiae,whichresultinaccumulationoffluorescentproduct,Appl. Elnviron.Micriobiol., 61 (4): 1614-9 (1995 年 4 月);deBoer和Beumer,Methodology fordetectionandtypingoffoodbornemicroorganism,Int.J.Food. Microbiol.,50(1-2):119-30(1999 年 9 月))。
[0016] 流式细胞术的主要优势是其快速且易于进行。流式细胞术适于不同类型的样品和 方法,使得它成为还可W是自动化处理的鲁棒性应用。众多流式细胞术应用出现在工业生 物技术、食品和药物质量控制、饮用水与废水的日常监测、和±壤与天然水生生境中的微生 物生态研究中是毫不令人惊讶的。流式细胞术结果与标准平板计数方法的结果密切关联。 然而,流式细胞术具有其它的限制,比如需要染料标记用于检测的目标微生物、高成本的设 备和需要对人员专业训练。此技术的扩展和日常使用已经开始缓解运些缺点。
[0017] 然而,流式细胞术依然具有其它实践问题,尤其是在分析源自被称为"复合基 质"的生物或环境样品的背景下。复合基质可W由干扰检测生物或环境样品中的微生物 的物质组成。对检测的进一步限制是通过W下因素施加的:非特异性巧光的干扰、或小 于最佳检测极限的微粒物质、将方法应用至固体或微粒食物样品的困难、除非使用特殊 染色否则不能区分活细胞或死细胞、和在样品处理期间还可W出现的对细胞存活的破坏 (Quintero-Bet曰ncourt等人,CryptosporidiumP曰rvum曰ndCyclospor曰c曰yet曰nensis:曰 reviewoflaboratorymethodsfordetectionofthewaterborneparasites,J. Microbiol.Methods, 49(3):209-24(2002 年 5 月))。
[0018] 样品中干扰物质或微粒物质的存在增大了背景噪声并使得使用流式细胞术的生 物或环境样品的分析复杂化。考虑到运些缺点,由于研究者已经认为流式细胞术对日常使 用不是非常有前景,许多研究者已经不愿意彻底探索使用流式细胞术用于分析样品,尤其 是那些包含微粒的。
[0019] 因为细胞壁结构和巧光染料的渗透性质,有时在染色溶液中需要试剂比如邸TA W使革兰氏阴性菌细胞的外膜不稳定和增大染料摄取。复合基质比如碎牛肉提取物中的一 些革兰氏阴性菌的染色强度不如缓冲液或含少量复合基质的缓冲溶液中的细菌的染色强 度高,并且添加邸TA不能解决运些类型样品的低染色强度问题。结果,某些生物的染色群 体非常接近背景,并且低信号与背景比将最终影响计数的准确度和灵敏性。
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