核酸制备和分析的组合物和方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年12月3日提交的美国临时专利申请No. 61/732,823的优先 权权益，其通过引用W其整体并入。
技术领域
[0003] 本申请一般性地设及核酸样品制备和测序领域。
【背景技术】
[0004] 核酸序列分析工具是鉴定基因改变的基础，其进而可用于诊断遗传疾病、预测对 药物治疗的响应性W及分析药物的药物基因组学。由于测序分析经常设及在有限量的样品 中确定稀有的遗传改变，因此灵敏度是一个大的挑战。在分析组织样品（如癌症样品）中 的体细胞突变时尤其如此，所述组织样品经常包含与具有突变之细胞混合的正常细胞。
[0005] 为了增加灵敏度，使用了多种核酸扩增方法。最常用的扩增方法是聚合酶链式反 应（"PCR")，其设及使用Taq聚合酶来进行多个循环的扩增。因为Taq聚合酶固有的保真 性（fidelity)问题，所WPCR方法经常产生可掩盖待分析之真正突变的人工突变，使得极 难检测样品中的稀有突变。因此，可能降低核酸方法的精确度。
[0006] 人基因组DNA很复杂并且具有很多重复序列。运为序列分析带来了另外的挑战。 首先，目的多核巧酸在多核巧酸混合物中的代表性可能显著不足。其次，分析复杂DNA样品 的成本可能极其昂贵，特别是在分析基因组DNA和检测多个遗传突变的情况下。虽然已开 发了多种下一代测序方法，但是仍然需要灵敏、精确且有效的核酸制备和测序分析方法。
[0007] 本文引用的所有参考文献（包括专利申请和出版物）均通过引用W其整体并入。
【发明内容】
[0008] 在一个方面中，本申请提供了产生包含不对称接头（adaptor)序列的单链多核巧 酸的方法，其包括：i)使一个或更多个DNA片段与W下接头连接：a)包含标签的第一接头， 和b)包含识别序列的第二接头；ii)基于标签的存在选择包含所述第一接头的DNA片段； iii)使用包含RNA并与识别序列杂交的引物通过单链多核巧酸扩增来扩增步骤ii)中选择 的DNA片段，从而选择性扩增包含所述第二接头的DNA片段。在一些实施方案中，通过使双 链祀DNA(例如，基因组DNA)片段化来产生所述一个或更多个DNA片段。在一些实施方案 中，使步骤ii)中选择的DNA片段的一条链与其互补链物理分离后，将其用作单链多核巧酸 扩增的模板。
[0009] 在一些实施方案中，提供了由双链祀DNA产生包含接头序列的单链多核巧酸的方 法，其包括：i)用限制性内切核酸酶切割双链祀DNAW产生具有5'或3'突出端的DNA片 段；ii)使所述DNA片段与接头连接，所述接头包含：a)与所述DNA片段的5'或3'突出端 互补的单链5'或3'突出端和b)识别序列；W及iii)使用包含RNA并与识别序列杂交的 引物通过单链多核巧酸扩增来扩增与所述接头连接的DNA片段。在一些实施方案中，使与 所述接头连接的DM片段进一步片段化后，对其进行单链多核巧酸扩增。
[0010] 在根据W上段落所述的任意一个实施方案的一些实施方案中，所述方法还包括由 所述单链多核巧酸制备多核巧酸文库。
[0011] 在根据W上段落所述的任意一个实施方案的一些实施方案中，所述方法还包括将 所述单链多核巧酸固定在固体支持物上。
[0012] 在根据W上段落所述的任意一个实施方案的一些实施方案中，所述方法还包括对 所述单链多核巧酸进行分析（例如测序）。
[0013] 在一些实施方案中，提供了对祀多核巧酸上的一个或更多个期望区域进行分析 (例如，测序）的方法，其中所述一个或更多个期望区域可与探针组杂交，所述方法包括：1) 使由所述祀多核巧酸产生的单链多核巧酸群与探针组相接触；2)使与探针结合的多核巧 酸与其余的多核巧酸分离，其中包含一个或更多个期望区域的多核巧酸被富集；3)对分离 的多核巧酸进行分析（例如，测序）。在一些实施方案中，使用包含RNA的引物并使用由所 述祀多核巧酸产生的DNA片段作为模板通过单链多核巧酸扩增而由所述祀多核巧酸产生 单链多核巧酸群。在一些实施方案中，所述一个或更多个期望区域是癌基因所在的区域。在 一些实施方案中，探针组包含至少约10种不同的多核巧酸探针。在一些实施方案中，多核 巧酸探针组包含至少约50种不同的多核巧酸探针。在一些实施方案中，祀多核巧酸是RNA。 在一些实施方案中，祀多核巧酸是双链DNA(例如，基因组DNA)。在一些实施方案中，单链多 核巧酸群通过W上段落所述的方法来产生。
[0014] 在根据上述任意一个实施方案的一些实施方案中，单链多核巧酸扩增包括：a)在 复合体中延伸包含RNA的引物，所述复合体包含：i)待扩增的DNA片段和ii)包含RNA的 引物，其中使所述包含RNA的引物与所述待扩增的DNA片段杂交；W及b)用从RNA/DNA杂 合体切割RNA的酶切割引物的RNA部分，W使得另一包含RNA的引物与DNA片段杂交并通 过链置换来重复引物延伸；从而产生单链多核巧酸的多个拷贝。
[0015] 在根据上述任意一个实施方案的一些实施方案中，单链多核巧酸扩增包括使用 RNA引物。在一些实施方案中，单链多核巧酸扩增包括使用DNA-RNA复合引物。在一些实 施方案中，延伸通过选自W下的DNA聚合酶来进行：链置换DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、 具有校正活性的聚合酶、T7 DNA聚合酶和大肠杆菌化coli)DNA聚合酶。在一些实施方案 中，从RNA/DNA杂合体切割RNA的酶是RNase H或RNase I。
[0016] 在一些实施方案中，提供了运样的试剂盒，其包含i)包含标签的第一接头；和b) 包含识别序列的第二接头；和iii)与所述识别序列杂交的引物。在一些实施方案中，试剂 盒还包含与所述标签结合的配体。在一些实施方案中，试剂盒还包含固体支持物。在一些 实施方案中，引物包含RNA。在一些实施方案中，引物是RNA引物。在一些实施方案中，引物 是DNA/RNA复合引物。在一些实施方案中，引物为约5至约30个核巧酸。在一些实施方案 中，试剂盒还包含从RNA/DNA杂合体切割RNA的酶（例如，RNaseH或RNaseI)。在一些实 施方案中，试剂盒还包含DNA聚合酶，例如，选自W下的DNA聚合物：链置换DNA聚合酶、高 保真DNA聚合酶、具有校正活性的聚合酶、T7DNA聚合酶和大肠杆菌DNA聚合酶。在一些 实施方案中，试剂盒还包含DNA连接酶。在一些实施方案中，试剂盒还包含一种或更多种探 针。在一些实施方案中，试剂盒还包含用于进行任意一种本文所述方法的说明书。
【附图说明】
[0017] 图1描绘了使用不对称接头处理DM的一种示例性方法。
[0018] 图2描绘了使用限制性酶消化处理DNA的一种示例性方法。
[0019] 发明详述
[0020] 本申请提供了核酸制备和分析的方法，其允许灵敏、精确和有效地确定核酸序列。 所述方法通常包括通过使用单链多核巧酸扩增来扩增祀多核巧酸W产生单链多核巧酸。可 例如通过添加一个或更多个接头来处理祀核酸，并且可选择包含一个或更多个接头的核酸 并将其用于产生单链多核巧酸。可通过使用与单链多核巧酸上的目的区域杂交的探针组进 一步富集单链多核巧酸中包含目的区域的多核巧酸。
[0021] 因此，在一个方面中，本申请提供了产生包含一个或更多个接头的单链多核巧酸 的方法。
[0022] 在另一个方面中，提供了分析祀多核巧酸上的一个或更多个期望区域的方法。
[0023] 在另一个方面中，提供了可用于本文所述方法的试剂盒、组合物和制品。
[0024] I.定义
[00巧]本文使用的"单链多核巧酸扩增"是指通过在包含祀多核巧酸序列的单链模板核 酸上重复延伸单个引物来合成单链子链的多个拷贝。新合成的核酸分子在后续的引物延伸 反应期间不能用作产生另外的核酸分子的模板。
[00%] 本文使用的"扩增"一般是指产生期望序列的两个或更多个拷贝的过程。本文中 可互换使用的"多核巧酸"或"核酸"是指任意长度的核巧酸聚合物，包括DNA和RNA。所述 核巧酸可W是脱氧核糖核巧酸、核糖核巧酸、经修饰的核巧酸或碱基和/或其类似物、或者 可通过DNA聚合酶或RNA聚合酶并入聚合物中的任何底物。多核巧酸可包含经修饰的核巧 酸，例如甲基化的核巧酸及其类似物。
[0027] 本文中使用的"寡核巧酸"一般是指短的、一般为单链的、一般为合成的多核巧酸， 其长度一般（但不一定）不超过约200个核巧酸。术语"寡核巧酸"和"多核巧酸"并不互 相排斥。W上对于多核巧酸的描述同样完全适用于寡核巧酸。
[0028] 本文使用的使多核巧酸"片段化"是指使多核巧酸断裂成不同的多核巧酸片段。片 段化可例如通过剪切或通过酶促反应来实现。
[0029] "引物"一般是短的单链多核巧酸，一般具有游离3' -0H基团，其通过与祀序列杂 交而与目的祀标结合，并随后促进与祀标互补之多核巧酸的聚合。
[0030] 本文使用的术语"标签"是指可用于将连接有标签的分子与不包含所述标签的其 他分子分开的部分。
[0031] 本文使用的术语"末端核巧酸"是指位于核酸分子5'端或3'端的核巧酸。
[0032] "杂交"和"退火"是指其中一个或更多个多核巧酸反应W形成复合体的反应，所述 复合体通过核巧酸残基碱基之间的氨键键合而稳定化。氨键键合可通过Watson-化ick碱 基配对、化ogstein结合或者通过任何其他序列特异性方式发生。
[0033] 本文使用的"接头"是指可与多核巧酸片段连接的寡核巧酸。
[0034] 本文关于两个多核巧酸（如接头和多核巧酸片段）使用的术语"连接"是指两个 单独的多核巧酸共价连接W产生具有连续骨架的单个更大的多核巧酸。
[0035] 术语"3'"-般是指多核巧酸或寡核巧酸中位于同一多核巧酸或寡核巧酸中另一 区域或位置下游的区域或位置。
[0036] 术语"5'"-般是指多核巧酸或寡核巧酸中位于同一多核巧酸或寡核巧酸中另一 区域或位置上游的区域或位置。
[0037] "5'突出端"是延伸超过双链核酸分子5'端的一段（stretch)未配对核巧酸。例 如，5'突出端可W是单个未配对核巧酸，或者其可W为至少5、10、15或超过15个核巧酸长。 例如，引物可包含，例如5至25个不与例如模板链中存在的序列和/或祀多核巧酸序列互 补的核巧酸。换言之，在引物的其他部分与祀多核巧酸杂交的情况下，5'突出端的核巧酸不 与祀多核巧酸序列杂交。
[003引 "3'突出端"是延伸超过双链核酸分子3'端的一段未配对核巧酸。例如，3'突出 端可W是单个未配对核巧酸，或者其可W为至少5、10、15或超过15个核巧酸长。例如，弓I 物可包含，例如5至25个不与例如模板链中存在的序列和/或祀多核巧酸序列互补的核巧 酸。换言之，在引物的其他部分与祀多核巧酸杂交的情况下，3'突出端的核巧酸不与祀多核 巧酸序列杂交。
[0039] 本文使用的术语"祀多核巧酸"是指包含一个或更多个目的序列和正在研究的序 列的多核巧酸。
[0040] 本文使用的"阵列"包括具有空间或光学可寻址（acMress油le)区域之核酸或其 他分子的排列。当阵列是核酸阵列时，核酸可在沿核酸链的任意点被物理吸附、化学吸附或 共价连接至所述阵列。
[0041] 术语"确定"、"测量"、"评价"、"评估"、"测定"和"分析"在本文中可互换使用，是指 任意形式的测量并且包括确定要素是否存在。运些术语包括定量确定和/定性确定二者。 评估可W是相对的或绝对的。"评估......的存在"包括确定物质存在的量W及确定其是 否存在。
[0042] 本文使用的术语"单核巧酸多态性"或简称"SNP"是指基因组序列中特定位点处 的单个核巧酸的改变，导致在群体中W可感知频率（例如，群体中至少1% )出现的两个或 更多个替代等位基因。
[0043] 本文使用的术语"变性"是指使核酸双链体分为两条单链。
[0044] 术语"富集"是指使样品中特定核酸序列的相对丰度相对于处理前所述样品中最 初存在的整体核酸序列水平提高的过程。因此，富集步骤提供了相对百分比或分数提高，而 不是直接提高（例如目的核酸序列的绝对拷贝数）。在富集步骤之后，待分析样品可称为富 集的多核巧酸或经选择的多核巧酸。 W45] 本文使用的核酸样品的"复杂性（complexity)"是指所述样品中存在的不同的独 特序列的数目。如果样品不如其所来源的核酸样品复杂，则认为该样品具有"降低的复杂 性"。
[0046] 本文使用的"固体支持物